الأبتامرات هي ribo-/deoxyribo-oligonucleotides القصيرة المختارة من قبل في المختبر تطور الأساليب على أساس تقارب لهدف محدد. الأبتامرات هي أدوات متعددة الاستخدامات مع الاعتراف الجزيئية التطبيقات العلاجية والتشخيصية ، والبحوث. نظهر طرق لاختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد β ، العامل المسبب للمرض الزهايمر.
يتطلب اشتراك JoVE لعرض هذا المحتوى. تسجيل الدخول أو ابدأ نسخة تجريبية مجانية
مقالة منهجية
اختيار الأبتامرات للبروتين اميلويد - β ، والمسبب لمرض الزهايمر
في هذه المقالة
ملخص
الملخص
مرض الزهايمر (ميلادي) هو التقدمية ، التي تعتمد على العمر ، واضطراب الاعصاب مع دورة الغادر الذي يجعل من الصعب تشخيصه سابق للأعراض 1. ويتحقق تشخيص محدد ميلادي بعد الوفاة فقط ، وبالتالي وضع سابق للأعراض ، والتشخيص المبكر للميلادي أمر بالغ الأهمية لتطوير علاجات فعالة وبالإدارة 2،3.
β البروتين اميلويد (Aβ) أمر أساسي لالمرضية ميلادي. ويعتقد ، oligomeric ذوبان المجالس Aβ أن يؤثر ضعف العصبية الكامنة متشابك وفقدان الخلايا العصبية في 4،5 م. وقد وصفت مختلف أشكال التجمعات Aβ القابلة للذوبان ، ومع ذلك ، ترابطها وصلتها المسببات المرضية ميلادي ومعقدة وغير مفهومة جيدا 6. قد أدوات محددة الاعتراف الجزيئية كشف العلاقات بين المجالس Aβ وتسهيل الكشف وتوصيف هذه المجالس في وقت مبكر من أعراض المرض قبل الدورة الظهور. الاعتراف الجزيئية تعتمد عادة على الأجسام المضادة. ومع ذلك ، فئة بديلة من أدوات التعرف الجزيئي ، الأبتامرات ، ويقدم مزايا هامة بالنسبة إلى 7،8 الأضداد. [أليغنوكليوتيد] الأبتامرات هي التي تولدها في المختبر الاختيار : التطور المنهجي للتخصيب بواسطة يغاندس الأسي (سيليكس) 9،10. سيليكس هي عملية تكرارية ، مماثلة لنظرية التطور الداروينية ، ويتيح الاختيار ، والتضخيم ، والإثراء ، وإدامة الممتلكات ، على سبيل المثال ، متعطشا ومحددة وملزمة يجند (الأبتامرات) أو أي نشاط الحفاز (ribozymes وDNAzymes).
على الرغم من ظهور الأبتامرات كأدوات في مجال التكنولوجيا الحيوية الحديثة والطب 11 ، وقد كانوا غير مستغلة في مجال اميلويد. وقد تم اختيار عدد قليل أو RNA الأبتامرات ssDNA ضد أشكال مختلفة من بروتينات بريون (بي ار بي) 12-16. وقد أبدت aptamer RNA الناتجة ضد المؤتلف البقري بي ار بي بي ار بي الاعتراف البقري β - 17 ، ، oligomeric القابلة للذوبان ، β ورقة الغنية متعلق بتكوين متغير من كامل طول بي ار بي الذي يشكل ييفات اميلويد 18. ولدت الأبتامرات باستخدام نماذج موحودي والعديد من β ييفي تم العثور على 2 - المكروغلوبولين (β 2 م) لربط ييفات من بروتينات معينة amyloidogenic أخرى إلى جانب β ييفات م 2 19. Ylera وآخرون. وصف الأبتامرات RNA مختارة ضد يجمد 20 Aβ40 موحودي. بشكل غير متوقع ، وهذه الأبتامرات ملزمة لييفي Aβ40. تماما ، وهذه البيانات تثير تساؤلات عديدة هامة. لماذا اختيار الأبتامرات ضد بروتينات موحودي الاعتراف أشكالها البوليمرية؟ ويمكن الحصول على استمارات الأبتامرات ضد موحودي و / أو البروتينات oligomeric amyloidogenic؟ للتصدي لهذه الأسئلة ، وحاولنا تحديد الأبتامرات لتساهميا استقرت 21 Aβ40 oligomeric تم إنشاؤها باستخدام الصورة التي يسببها عبر ربط بروتينات معدلة (PICUP) 22،23. مشابهة لنتائج سابقة 17،19،20 ، تفاعلت مع هذه الأبتامرات ييفات Aβ من البروتينات وغيرها من عدة amyloidogenic الاعتراف الأرجح اميلويد مشتركة محتملة الهيكلية aptatope 21. هنا ، فإننا نقدم سيليكس منهجية المستخدمة في إنتاج هذه الأبتامرات 21.
البروتوكول
الجزء 1 : إعداد البروتين وعبر ربط ،
في البداية ، هو سابقة التجهيز للبروتين يستخدم لسيليكس مع بروبانول 1،1،1،3،3،3 - hexafluoro - 2 (HFIP) للحصول على واحدة متجانسة ، خالية من مجموع الأعمال التحضيرية ، كما هو موضح سابقا 23. هذه الخطوة كانت ضرورية لأن ما قبل تشكيل المجاميع حمل التجميع السريع للبروتينات amyloidogenic ، مما أدى إلى استنساخ التجارب الفقراء 24 عاما ، وغير مرغوب فيها لاختيار الأبتامرات unaggregated عن أشكال غير لييفي ، من البروتين.
- ~ خارج ت....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المناقشة
نقطة الانطلاق لعملية سيليكس هو توليف مكتبة تحتوي على قليل النوكليوتيد عشوائي عادة 10 12 15 -10 متواليات. سيليكس في الحمض النووي ، ويتم استخدام هذه المكتبة مباشرة بعد إنشاء تجمع ssDNA ، في حين سيليكس RNA ، تظاهر هنا ، هو تحويل مكتبة ssDNA أول حمام سباحة إنزيمي بواسطة الحمض النووي الريبي في المختبر النسخ. ثم ، يتم تنفيذ سيليكس تكرارا حيث تضم كل دورة من التعرض وملزم [أليغنوكليوتيد] إلى الهدف المقصود ، وتقسيم المجلدات من غير ملزم متواليات ، وشطف للتسلسل ملزمة. في ا.......
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
الإفصاحات
الإعلان عن أي تضارب في المصالح.
شكر وتقدير
وأيد هذا العمل عن طريق منح من المعاهد الوطنية للصحة AG030709 / NIA و07-65798 من وزارة الصحة العامة في ولاية كاليفورنيا. نعترف مارغريت M. Condron لتخليق الببتيد وتحليل الحمض الأميني ، الدكتورة اليزابيث واو نويفلد لمساعدة ودعم الخطوات الأولية للمشروع ، والدكتور تشي تشن هونغ باء لتقديم الدعم والكواشف ، والدكتور أندرو دال . إلينغتون لإجراء مناقشات مفيدة.
....الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
المواد
| الاسم | الشركة | رقم فهرسي | التعليقات |
|---|---|---|---|
| أβ40 | مختبر البوليمرات الحيوية بجامعة كاليفورنيا، لوس أنجلوس (UCLA) | مسحوق مجفف بالتجميد | |
| الميزان الدقيق MX5 Automated-S | Mettler Toledo | ||
| أنابيب سعة 1.6 مل، مطلية بالسيليكون | Denville Scientific | C19033 أو C19035 | |
| 1,1,1,3,3,3-سداسي فلورو-2-بروبانول (HFIP) | TCI America | H0424 | يُستخدم داخل خزانة استرداد الغازات (fume hood). |
| برسلفات الأمونيوم | Sigma-Aldrich | A-7460 | رُجّ المزيج بجهاز الرج الميكانيكي (Vortex) حتى يصبح المحلول رائقاً. يتم تحضير APS حديثاً في كل مرة، ويجب استخدامه خلال 48 ساعة. |
| سداسي هيدرات ثنائي كلورو تريس(2،2-بيبريديل) روتينيوم(II) | Sigma-Aldrich | 224758-1G | يُرج المحلول بجهاز الرج المداري (Vortex) حتى يصبح رائقاً. يُغطى أنبوب RuBpy بورق القصدير لحماية الكاشف من الضوء المحيط. يتم تحضير RuBpy طازجاً في كل مرة، ويجب استخدامه في غضون 48 ساعة. |
| ديثيوثريتول (DTT) | Sigma-Aldrich | 43815 | |
| ملح-D™ إكسيلسيلوز (Excellulose)™ أعمدة إزالة الأملاح | Thermo Fisher Scientific, Inc. | 20449 | |
| خلات الأمونيوم | Fisher Scientific | A637-500 | |
| أنابيب بسعة 0.6 مل مطلية بالسيليكون | Denville Scientific | C19063 | |
| هلامات Novex Tricine (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10 آبار؛ حجم صغير (8 سم × 8 سم)؛ 25 μحجم التحميل لكل بئر؛ نطاق الفصل من 5 كيلو دالتون إلى 40 كيلو دالتون |
| كيوفت كوارتز | Hellma | 105.250-QS | |
| مقياس الطيف الضوئي Beckman DU 640 | Beckman Coulter Inc. | ||
| مكتبة DNA أحادي السلسلة | Integrated DNA Technologies | مطلوب حسب الطلب | صُممت المكتبة لتتضمن 49 نيوكليوتيداً عشوائياً تحيط بها منطقتان ثابتتان تحتويان على مواقع ارتباط البادئ ومواقع الاستنساخ: 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3’ |
| إنزيم Taq DNA polymerase | USB Corp.، Affymetrix | 71160 | مؤتلف <مجهر إلكتروني>*Thermus aquaticus* إنزيم DNA Polymerase المورد بتركيز 10× محلول منظم لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR Buffer) وأنبوب منفصل يحتوي على كلوريد المغنيسيوم (MgCl2) بتركيز 25 ملي مولار2 لتفاعلات PCR الروتينية. |
| مزيج نيوكليوتيدات لتفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR)، محلول بتركيز 10 ملي مولار | USB Corp.، Affymetrix | 77212 | (10 ملي مولار لكل من dATP وdCTP وdGTP وdTTP) |
| بادئ أمامي | Integrated DNA Technologies | مطلوب حسب الطلب | 5’-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3’ |
| البادئ العكسي | Integrated DNA Technologies | مطلوب بمواصفات خاصة | 5’-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3’ |
| جهاز التدوير الحراري | Denville Scientific | Techne TC-312 | |
| طقم QIAquick PCR Purification Kit (50) | Qiagen | 28104 | |
| أجاروز | Denville Scientific | CA3510-8 | |
| أنابيب مخروطية معقمة سعة 1.6 مل، ذات أغطية مثبتة بحلقات دائرية مانعة للتسرب (O-rings) | Denville Scientific | C19040-S | |
| RiboMAX™ نظام إنتاج الحمض النووي الريبوزي (RNA) على نطاق واسع–T7 | Promega Corp. | P1300 | تحتوي المجموعة على: 120 μمزيج الإنزيمات (RNA polymerase، وRNasin المؤتلف)® مثبط الريبونوكلياز والبيروفوسفاتاز غير العضوي المؤتلف)؛ 240 μمحلول منظم لعملية النسخ 5؛ 100 μلكل من 4 rNTPs، بتركيز 100 ميلي مولار؛ 110 وحدة من RQ1 RNase-free DNase، بمعدل 1 وحدة/μل؛ 10 μحمض نووي ريبوزي منقوص الأكسجين (DNA) خطي للتحكم، 1 مجم/مل؛ 1 مل خلات الصوديوم 3 مولار (الرقم الهيدروجيني 5.2)؛ 1.25 مل ماء خالٍ من النوكلياز |
| α-32بي-سيتيدين 5’-ثلاثي الفوسفات، 250 μكوري (9.25 ميجابيكريل)، | PerkinElmer, Inc. | BLU008H250UC | النشاط النوعي: 3000 Ci (111 TBq)/mmol، 50 mM Tricine (pH 7.6) |
| فينول:كلوروفورم:كحول إيزواميل المشبع بالسترات (125:24:1، الرقم الهيدروجيني 4.7) | Sigma-Aldrich | 77619 | |
| كلوروفورم: كحول الإيزوأميل (24:1) | Sigma-Aldrich | C0549 | |
| الإيثانول المطلق للبيولوجيا الجزيئية | Sigma-Aldrich | E7023 | |
| جهاز طرد مركزي دقيق مبرد Z216-MK | Denville Scientific | C0216-MK | |
| illustra ProbeQuant™ أعمدة دقيقة من نوع G-50 | GE Healthcare | تم الحصول عليه من شركة Fisher Scientific (45-001-487) | معبأة مسبقاً بمادة Sephadex™ من درجة G-50 المخصصة للحمض النووي (DNA Grade) والموازنة مسبقاً في محلول STE المنظم الذي يحتوي على 0.15% من مادة Kathon كمبيد حيوي. |
| عداد الومضان المختبري Triathler | Hidex Oy، توركو، فنلندا | نموذج Triathler LSC: 425-034 | |
| Novex® محلول منظم عازل للعينات من TBE-اليوريا (2×) | Invitrogen | LC6876 | |
| هلام TBE-Urea بتركيز 6%، سمك 1.0 مم، 10 آبار | Invitrogen | EC6865BOX | |
| Novex® محلول التخزين الكهربائي TBE (5×) | Invitrogen | LC6675 | |
| مُزيل التلوث الإشعاعي | Fisher Scientific | 04-355-67 | |
| رؤوس تحميل الهلام | Denville Scientific | P3080 | |
| إكس سيل (XCell) <مجهر إلكتروني>SureLock خلية مصغرة | Invitrogen | EI0001 | XCell <مجهر إلكتروني>SureLock الخلية الصغيرة |
| فيلم التصوير الشعاعي الذاتي | Denville Scientific | E3018 | يُستخدم في ظلام تام |
| فيلم التصوير الشعاعي الذاتي، Hyperfilm™ الوميض الكيميائي الكهربائي (ECL) | Amersham | RPN3114K | يمكن استخدامه تحت ضوء أحمر آمن. |
| أقراص غشائية | EMD Millipore | GSWP02500 | إستر السليلوز المختلط، محب للماء، 0.22-μأغشية m disc |
| قاعدة دعم زجاجية مسامية لدورق سعة 125 مل | VWR international | 26316-696 | |
| أطباق بتري | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | |
| اليوريا | Fisher Scientific | AC32738-0050 | |
| إيديتات (EDTA) | Fisher Scientific | 118430010 | |
| جليكوجين | Sigma-Aldrich | G1767 | |
| 2-بروبانول للبيولوجيا الجزيئية | Sigma-Aldrich | I9516 | |
| مثبط RNase المؤتلف | USB Corp.، Affymetrix | 71571 | |
| ImProm-II™نظام النسخ العكسي | Promega Corp. | A3802 | |
| مثبط RNase مأشوب | USB Corp.، Affymetrix | 71571 | |
| التشغيل السريع (RapidRun)™ صبغة التحميل | USB Corp.، وAffymetrix | 77524 |
المراجع
- Monien, B. H., Apostolova, L. G., Bitan, G. Early diagnostics and therapeutics for Alzheimer's disease-how early can we get there. Expert. Rev. Neurother. 6, 1293-1306 (2006).
- Nestor, P. J., Scheltens, P., Hodges, J. R. Advances in the early detection of Alzheimer's d....
الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.
إعادة الطباعة والأذونات
الوسوم
