تزامن الديدان الخيطية: طريقة للحصول على مجموعات الديدان في مراحل متطابقة من التطور

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Sarasija، S. and Norman، K. R. قياس معدلات استهلاك الأكسجين في Caenorhabditis elegans السليمة. J. Vis. Exp. (2019).

في هذا الفيديو ، نعرض طريقة لإنتاج مجموعة متزامنة تنمويا من C. ايليجانس البالغين المعقمين. يقوم بروتوكول المثال بمزامنة الديدان لدراسة معدلات استهلاك الأكسجين في الحية.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Sarasija and Norman ، قياس معدلات استهلاك الأكسجين في Caenorhabditis elegans السليم ، J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_title" >1. نمو وتزامن أعداد الديدان الخيطية

< p class = "jove_content">ستصل هذه إلى مرحلة اليرقات L4 بعد ~ 42 ساعة. في هذا الوقت ، انقل يرقات L4 باستخدام معول بلاتيني إلى ألواح NGM المصنفة OP50 التي تحتوي على 0.5 مجم / مل 5-fluoro-2'-deoxyuridine (FUdR) لمنعها من إنتاج ذرية.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة تأكد من مزامنة جميع السلالات داخل التجربة لفترة زمنية مماثلة. يعمل علاج FUdR على تعقيم ويمنع وضع البيض وإنتاج النسل ، مما قد يؤثر على التعرف الضوئي على الحروف. سيتم تحليل هذه المعقمة في اليوم التالي (اليوم 1 البالغة عند ~ 66 ساعة) للفحص. تم الإبلاغ عن أن FUdR يؤثر على علم وظائف الأعضاء وعمر بعض الديدان الطافرة. لذلك ، يجب أن يؤخذ ذلك في الاعتبار عند استخدام الدواء للتعقيم. يمكن أيضا تعقيم الديدان عن طريق تأنيث الطفرات مثل fem-1 (hc17) أو fem-3 (e2006). ومع ذلك ، قد تؤثر هذه الطفرات على وظيفة الميتوكوندريا.

1. انقل يرقات L4 من الخلفيات الجينية المرغوبة (على سبيل المثال ، N2 [النوع البري] و sel-12) إلى ألواح وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) (انظر الجدول 1 للحصول على وصفة) بذرة طازجة مع عشب من الإشريكية القولونية (OP50). استخدم ما لا يقل عن لوحين مقاس 100 مم أو ثلاث ألواح مقاس 60 مم لكل سلالة. احتضان الديدان في درجة حرارة النمو المناسبة (بين 15-25 درجة مئوية) لمدة 3-4 أيام أو حتى تتركز الصفائح بعدد كبير من البيض والديدان الحاملة.
2. اغسل البيض والديدان من الألواح باستخدام حوالي 6 مل من المخزن المؤقت M9 (انظر الجدول 1 للوصفة) لكل صفيحة 100 مم من الديدان الخيطية وانقلها باستخدام ماصات باستور الزجاجية إلى أنابيب طرد مركزي فردية سعة 15 مل لكل سلالة. قم بتدوير هذه الأنابيب لأسفل لمدة 3 دقائق عند 6,180 × جم واستنشق المخزن المؤقت M9 ، مع الاحتفاظ فقط بالحيوانات وحبيبات البيض.
3. أضف 3-4 مل من محلول التبييض (انظر الجدول 1 للحصول على وصفة) إلى كل أنبوب ودوامة متقطعة لمدة 6 دقائق. أضف المخزن المؤقت M9 لملء كل أنبوب وقم بالدوران عند 6،180 × جم لمدة دقيقة واحدة وشفط المادة الطافية. كرر هذا الغسيل باستخدام M9 ثلاث مرات وانقل حبيبات البيض إلى أنبوب جديد سعة 15 مل يحتوي على حوالي 9 مل من المخزن المؤقت M9.
4. قم بمزامنة الديدان الطازجة عن طريق الجوز عند 20 درجة مئوية لمدة 16-48 ساعة. قم بتدوير هذه الأنابيب لأسفل عند 6,180 × جم لمدة 1.5 دقيقة وضع L1 المتزامنة على ألواح NGM الفردية المصنفة حديثا بحديقة من OP50 (حوالي 6,000-10,000 لكل صفيحة 100 مم) واحتفظ بها عند 20 درجة مئوية.

النتائج

الجدول 1: وصفات لألواح NGM ، والمخزن المؤقت M9 ، ومحلول التبييض.

المخزن المؤقت M9 (1 لتر) dH2O 1,000 مل كلوريد الصوديوم 5 جرام كيه 2 ب 4 3 جرام

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td >100 مم ؛ أطباق بتري 60 مم < td > منتجات Kord-Valmark Labware < >2900؛ 2901 < تي دي > < td >15 مل أنابيب مخروطية كورنينج 430791 < td >50 مل أنابيب مخروطية كورنينج 430829 < td >أجار فيشر ساينتيك ص1423-2 < td > باكتو الببتون دينار بحريني; باكتو 211677 < td >باكتو تريبتون دينار بحريني; باكتو 211705 < td > مستخلص خميرة باكتو دينار بحريني; باكتو 212705 < td > التبييض العامه < td >ثنائي هيدرات كلوريد الكالسيوم (CaCl2 · 2H2O) فيشر ساينتيك سي 79-500 < td > الكوليسترول فيشر ساينتيك سي 314-500 الماء منزوع الأيونات (dH2O) ماصات باستور زجاجية كراكلر العلمية 6-72050-900 كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات (MgSO4 · 7H2O) فيشر ساينتيك ص213-1 فوسفات البوتاسيوم ثنائي القاعدة (K2HPO4) فيشر ساينتيك بي ت 363-1 < TD >فوسفات البوتاسيوم أحادي القاعدة (KH2PO4) فيشر ساينتيك ص 285-500 < td > كلوريد الصوديوم فيشر ساينتيك ص358-10 هيدروكسيد الصوديوم (NaOH) فيشر ساينتيك ص359-500 فوسفات الصوديوم ثنائي القاعدة اللامائي (Na2HPO4) فيشر ساينتيك ص ب 332-1