ذبابة الفاكهة تكييف الخطوبة: طريقة لاختبار التعلم والذاكرة في الذباب

الملخص

المصدر: Koemans ، T. S. ، et al. ذبابة الفاكهة تكييف المغازلة كمقياس للتعلم والذاكرة. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو اختبار تكييف كلاسيكي يختبر التعلم والذاكرة في ذبابة الفاكهة ، ويسمى تكييف الخطوبة. يعتمد الاختبار على تقليل مغازلة الذكور بعد تعرضهم للرفض من قبل أنثى خديجة غير متقبلة. يوضح مثال البروتوكول إعدادا للإجراء يمكن استخدامه لتقييم الذاكرة قصيرة المدى وطويلة المدى.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Koemans et al. ، ذبابة الفاكهة تكييف المغازلة كمقياس للتعلم والذاكرة ، J. Vis. Exp. (2017).

< strong class = "note" > NOTE: في البروتوكول الموضح أدناه ، يتم وصف نسخة مكررة واحدة من التجميع والتدريب والاختبار. من أجل اختبار قابلية تكرار النتائج ، يجب تكرار هذه الخطوات بالتوازي ، في أيام متعددة ، ومع مجموعات منفصلة من الذباب (الجدول 1). يعتمد البروتوكول على دورة حياة مدتها 10 أيام من البيضة إلى البالغين ، وهو أمر طبيعي عند تربية الذباب في ظل ظروف ثابتة تبلغ 25 درجة مئوية ، و 70٪ رطوبة ، ودورة ضوء / ظلام لمدة 12 ساعة. تفترض جميع جوانب هذا البروتوكول أن الظروف تظل ثابتة طوال الفحص بأكمله. يشار إلى الأوقات على أنها ساعات قبل تشغيل الأضواء (BLO) أو بعد تشغيل الأضواء (ALO) في الحاضنة ، حيث يمكن ضبط ذلك بسهولة اعتمادا على الوقت المفضل للباحث من اليوم. استخدم غاز ثاني أكسيد الكربون₂ فقط للجمع الأولي للذباب الذكور الساذجين ولجمع الإناث الخدج. يتكون هذا البروتوكول الخاص بتكييف الخطوبة من الخطوات التالية:

1. إنشاء ثقافات الجمع الإناث المبتسرات
2. إنشاء ثقافات لجمع الأشخاص الخاضعين للاختبار من الذكور
3. إعداد الكتل السكنية
4. إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث الخدج الموحدة
5. مجموعة من الأشخاص الذكور
6. تدريب
7. اختبار
8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

< p class = "jove_title" >1. إنشاء ثقافات مجموعة الإناث الخدج

1. تحضير powerfood. اغلي 0.8٪ (وزن / حجم) أجار ، 8٪ (وزن / حجم) خميرة ، 2٪ (وزن / حجم) مستخلص الخميرة ، 2٪ (وزن / حجم) بيبتون ، 3٪ (وزن / حجم) سكروز ، 6٪ (وزن / حجم) جلوكوز ، 0.05٪ (وزن / حجم) MgSO₄ ، و 0.05٪ (وزن / حجم) CaCl₂ في الماء لمدة 15 دقيقة. اترك المحلول يبرد إلى 70 درجة مئوية قبل إضافة 0.05٪ (وزن / حجم) ميثيل بارابين (تنبيه: سام) و 0.5٪ (حجم / حجم) حمض البروبيونيك (تنبيه: سام). تخلط جيدا عن طريق التقليب مع التبريد حتى 50 درجة مئوية للحصول على محلول متجانس.
2. قبل أن يتجمد الطعام في درجة حرارة الغرفة ، أضف ~ 50 مل من الطعام القوي إلى كل قارورة بلاستيكية سعة 175 مل. دع الطعام يبرد أكثر. أغلق القارورة بقابس.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: Powerfood هو خليط غذائي متخصص تم تركيبه خصيصا لإنتاج أعداد كبيرة من الذباب ، على الأرجح عن طريق تحفيز وضع البيض. لا يستخدم Powerfood لإنتاج ذكور الذباب التي سيتم استخدامها لتحليل السلوك (الخطوة 2) لأن النظام الغذائي غير النمطي والازدحام المحتمل قد يؤثران على النمو.
3. في اليوم -11 (الجدول 1) ، ابدأ 5-20 ثقافة من النوع البري بحوالي 60-100 ذبابة (مزيج من الذكور والإناث) في قوارير powerfood ؛ سيتم استخدامها في الخطوة 4 لإنتاج إناث موحدة قبل الزواج. أضف ورقة ترشيح إلى كل قارورة لزيادة المساحة التي يمكن أن تتشرنق عليها اليرقات ؛ سيؤدي ذلك إلى زيادة عدد الذباب الذي يمكنه الاحتمال.
4. كرر بشكل دوري الخطوات 1.1-1.3 طوال التجربة للحصول على ما يكفي من الذباب المغلق حديثا كمدخلات ل "إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث الخدج الموحدة" (الخطوة 4).

2. إنشاء ثقافات لجمع الأشخاص الخاضعين للاختبار من الذكور

1. تحضير طعام عادي مصنوع من 0.5٪ (وزن / حجم) أجار ، 2.75٪ (وزن / حجم) خميرة ، 5.2٪ (وزن / حجم) دقيق الذرة ، 11٪ (وزن / حجم) سكر ، 0.05٪ (وزن / حجم) ميثيل بارابين ، و 0.5٪ (حجم / حجم) حمض البروبيونيك في الماء ، كما هو موضح في الخطوتين 1.1 و 1.2. أغلق القوارير البلاستيكية سعة 175 مل بسدادة قارورة ذبابة.
2. في اليوم -10 (الجدول 1) ، ضع حوالي 10-20 ذكرا مع ما يقرب من 30-75 أنثى عذراء (جدول المواد / المعدات) في كل قارورة سعة 175 مل تحتوي على طعام عادي. أضف ورق ترشيح لزيادة مساحة سطح التشرنق وزيادة الإنتاجية.
3. قم بإنشاء ثلاث إلى ست قوارير سعة 175 مل لكل نمط وراثي للحصول على العدد المطلوب من الذكور الخاضعين للاختبار.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قد تكون هناك حاجة إلى المزيد من القوارير ، اعتمادا على إنتاجية النمط الجيني المطلوب.

< p class = "jove_title" >3. تحضير كتل الإسكان (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ)

1. قم بإذابة ما يقرب من 50 مل من الطعام القوي لكل كتلة سكنية في الميكروويف ، أو قم بإعدادها طازجة.
2. أضف 500 ميكرولتر من الطعام القوي إلى كل بئر من كتلة مسطحة القاع مكونة من 96 بئرا باستخدام ماصة متعددة الموزعين.
3. اترك الطعام يتجمد في درجة حرارة الغرفة.
4. قم بتغطية الكتل بغشاء لاصق PCR واستخدم إبرة لعمل 4 ثقوب على الأقل لكل بئر لتوفير الهواء النقي للذباب.
5. لكي تتمكن من فتح كل بئر ، استخدم شفرة حلاقة لقطع الفيلم اللاصق بالطول بين كل صف. اترك الفيلم سليما على أحد طرفي الكتلة.
6. يمكن تخزين الكتل عند 4 درجات مئوية لمدة تصل إلى يومين.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: اسمح للكتل بإعادة التوازن مع درجة حرارة الغرفة قبل الاستخدام.

4. إنشاء قوارير التزاوج لإنتاج الإناث الخدج الموحدة

1. في اليوم -1 ، قم بإزالة وتخلص من جميع الذباب البري البالغ من ثقافات مجموعة الإناث المبتسرة في 2-5 ساعات BLO.
2. اجمع الذباب باستخدام الشفاط (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب) من هذه القوارير على فترات من 2 إلى 3 ساعات (على سبيل المثال ، في 30 دقيقة و 2.5 ساعة و 5 ساعات ALO) وضعها في قارورة جديدة باورفود مكملة بكمية صغيرة من معجون الخميرة وورق الترشيح.
3. لتجنب الازدحام وتعزيز جو التزاوج الأمثل ، لا تنقل أكثر من 150-200 ذبابة إلى كل قارورة جديدة. ضمان تزاوج جميع الإناث من خلال توفير 25٪ على الأقل من الذكور. تأكد من وجود عدد كاف من الإناث في قوارير التزاوج لاستيعاب حجم التجربة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: نظرا لأن هذه خطوة حاسمة في البروتوكول ، تأكد من نقل الذباب المغلق حديثا فقط وعدم نقل الذباب أو اليرقات أو الشرانق القديمة إلى قارورة التزاوج الجديدة.
4. احتضان "قوارير التزاوج" هذه لمدة أربعة أيام لإتاحة الوقت الكافي لجميع الإناث للتزاوج.

5. مجموعة من الأشخاص الخاضعين للاختبار من الذكور

1. في اليوم 1 (الجدول 1) في 2-3 ساعات BLO ، استخدم ثاني أكسيد الكربون₂ لإزالة جميع الذباب البالغ من قوارير جمع الذكور (الخطوة 2) ، ولكن اترك المزيد من الذباب يقترب خلال الساعات القليلة المقبلة.
2. خلال 5-6 ساعات التالية ، قم بإزالة الذباب المغلق حديثا كل 20-30 دقيقة باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ وضع كل ذكر في بئر فردي من كتلة الإسكان (الخطوة 3) باستخدام الشافطة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب).
3. أعد إغلاق البئر بفيلم PCR اللاصق.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: هذه خطوة حاسمة في البروتوكول. يجب جمع الذكور بشكل متكرر. يجب عزل الذكور الذين تم جمعهم في كتلة الإسكان بالقرب من وقت الإغلاق ، عندما يظهرون تصبغا شاحبا ووجود العقي في البطن الشفاف.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الاستخدام اللطيف للشفاط يسمح بنقل الذباب ؛ ومع ذلك ، فإن الاستخدام غير المناسب سيؤدي إلى إجهاد الذباب ، مما يتسبب في تباين في الفحص (انظر المناقشة).
4. تهدف إلى جمع ما يصل إلى 48 ذكرا لكل نمط وراثي. يوفر هذا فائضا صغيرا إلى الحد الأقصى لعدد الذكور اللازمين لتحليل كل من الظروف الساذجة والمدربة ، مما يسمح ببعض الخسارة أثناء خطوات النقل اللاحقة.

< ص الفئة = "jove_title" >6. التدريب

1. قم بإزالة الذباب من قارورة التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ وافصل الإناث المبتسرات عن الذكور.
2. باستخدام الشفاط ، أضف أنثى واحدة مخدرة وخديجة إلى كل بئر في صف واحد من كتلة سكنية جديدة.
3. باستخدام الشفاط وبدون تخدير ، قم بنقل ذكر ساذج فردي من كتلة الإسكان التي تم إنشاؤها في الخطوة 5.2 إلى البئر الذي يحتوي على أنثى مبتسرة. بعد وضع الذكر في البئر ، أعد إغلاقه على الفور بالفيلم اللاصق ؛ لا تسمح للذكر بالهروب.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: انقل ذكور الذباب من الشفاط إلى الكتلة السكنية من خلال الاستفادة من سلوكهم الطبيعي "الجيوتاكس السلبي".
4. كرر الخطوات 6.2-6.3 حتى يتم إنشاء عدد كاف من الأزواج من الذكور والإناث. من الناحية المثالية ، قم بإنشاء 24 زوجا ، صفين كاملين من كتلة الإسكان ، لكل نمط جيني. اترك الذكور الساذجين المتبقين في الكتلة السكنية الأصلية التي تم إعدادها في الخطوة 5.2.
5. اترك الأزواج من الذكور والإناث دون إزعاج خلال فترة التدريب (الجدول 2 ، <الفئة القوية = "xfig" >الشكل 1ب).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: خلال هذا الوقت ، سيحاكم الذكر ويرفضه الأنثى المبكرة. بالنسبة للتعلم و STM ، فترة التدريب هي 1 ساعة وبالنسبة ل LTM ، فترة التدريب هي 7-9 ساعات.
6. قم بإنهاء التدريب (الجدول 2 ، <الفئة القوية = "xfig" >الشكل 1ب) باستخدام شفاط لفصل الذكر برفق عن الأنثى الخديجة ؛ لا تستخدم التخدير. ضع الذكر المنفصل في كتلة سكنية جديدة.
7. استخدم الشفاط لنقل جميع الذكور الساذجين برفق وبدون تخدير من كتلة الإسكان التي تم إعدادها في الخطوة 5.2 إلى كتلة سكنية جديدة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: هذه الخطوة اختيارية ل STM والتعلم ، ولكنها مهمة جدا ل LTM لأن الذباب يتم إيواؤه لمدة 24 ساعة إضافية لاختبار LTM.
8. بالنسبة ل STM و LTM ، اسمح للذكور بالراحة لمدة ساعة واحدة و ~ 24 ساعة ، على التوالي (الجدول 2 ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب) قبل الاختبار (الخطوة 7).
9. للتعلم ، اختبر على الفور الذكور المدربين والساذجين (الخطوة 7).

< p class = "jove_title" >7. الاختبار

1. اجمع الذباب من قوارير التزاوج (الخطوة 4.2) باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ وافصل الإناث المبتسرات عن الذكور.
2. دع الإناث تتعافى من التخدير لمدة 1 ساعة على الأقل في قارورة تحتوي على طعام طبيعي.
3. قم بتركيب مسجلات الفيديو مسبقا (<فئة قوية = "xfig" > الشكل 2ج) ، من أجل تجهيز جميع المعدات قبل بدء الاختبار.
4. ابدأ الاختبار وفقا للجداول الزمنية المختلفة للتعلم و STM و LTM (الجدول 2 ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب). قم بإجراء الاختبار مباشرة بعد التدريب للتعلم ، وبعد ساعة واحدة من التدريب على STM ، و 24 ساعة بعد التدريب على LTM.
5. باستخدام الشفاط ، انقل ذكرا فرديا برفق من كتلة السكن المريحة أو من كتلة سكن التدريب إذا تم اختبار التعلم (الخطوة 6.7 ، مدربة ؛ الخطوة 6.8 ، ساذجة) إلى نصف ساحة الخطوبة مع إغلاق الحاجز (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2D ؛ انظر الملف S1 للحصول على خطة بناء).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يكون استخدام سلوك "التاكسس الجيولوجي السلبي" الطبيعي كافيا لنقل الذباب الذكور من الشفاط إلى ساحة الخطوبة.
6. انقل فتحة الدخول بسرعة ولكن برفق إلى الساحة التالية وكرر الخطوة 7.5 حتى تحتوي جميع الساحات ال 18 على ذكر واحد.
7. باستخدام الشفاط وبدون ثاني أكسيد الكربون₂ ، أضف أنثى واحدة خديجة (تم جمعها في الخطوة 7.2) إلى النصف الآخر من جميع الساحات ال 18.
8. ضع غرفة الخطوبة بعناية أسفل الكاميرا ، بحيث تكون فتحة الآبار متجهة لأسفل (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ج).
9. قم بإزالة مقسم الساحات للسماح بالتفاعل المباشر بين الذكور والإناث الخدج.
10. ابدأ على الفور في تسجيل السلوك لمدة 10 دقائق على الأقل.
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: عند استخدام إعداد بكاميرتين ، يمكن إجراء التسجيل المتوازي للوحين من الخطوبة في أطر زمنية متداخلة لزيادة الكفاءة.
11. أفرغ ساحات الخطوبة باستخدام مكنسة كهربائية محمولة باليد واترك غرفة الخطوبة بالتهوية قبل إعادة الاستخدام.
12. كرر الخطوة 7.4-7.11 حتى يتم الانتهاء من اختبار جميع الأنماط الجينية والظروف (أي الساذجة والمدربة).

< p class = "jove_title" >8. تحليل بيانات الفيديو والإحصاءات

1. احسب مؤشر الخطوبة (CI) ، والذي يعرف بأنه النسبة المئوية للوقت الذي استغرقته محاكم الذكور خلال أول 10 دقائق من فترة الاختبار ، لكل ذبابة ذكر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن القيام بذلك يدويا من خلال مراقبة سلوك الخطوبة النمطي (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ) أو باستخدام برامج الكمبيوتر للقياس الكمي الآلي لسلوك الخطوبة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يوصى بتحليل 40-60 ذكرا لكل حالة على مدار ثلاثة أيام من أجل تحقيق قوة إحصائية كافية والحكم على اتساق بيانات CI.
2. احسب مؤشر التعلم (LI) ، الذي يعرف بأنه النسبة المئوية للانخفاض في متوسط CI للذكور المدربين مقارنة بالذكور الساذجين (LI = (CI_naïve -_{CI Trained}) / CI_ساذج). قم بتقييم LI لكل يوم من أيام الاختبار ومقارنته ب LI التراكمي المحسوب من جميع أيام الاختبار مجتمعة.
3. قم بإنشاء ملف بيانات منفصل من عمودين مع "Genotype" و "CI" كرؤوس.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: هذه العناوين حساسة لحالة الأحرف. يجب أن يتكون اسم النمط الجيني لكل CI من وصف للنمط الجيني متبوعا بشرطة سفلية وحالة التدريب (على سبيل المثال ، genotype_N و genotype_LTM ، وما إلى ذلك ، حيث N = ساذج و LTM = ذاكرة طويلة المدى ؛ انظر الملف التكميلي S2 للحصول على مثال). هذا التعليق التوضيحي ضروري ، حيث ستحدد الوظيفة analearn الذباب المدرب والساذج بناء على الأحرف الموجودة بعد التسطير السفلي الأول في عمود "النمط الجيني".
4. استخدم البرنامج النصي analearn R (الملف التكميلي S3) لإجراء اختبار عشوائي للحكم على الأهمية الإحصائية للاختلافات بين قيم LI من الأنماط الجينية المختلفة.
   1. مصدر البرنامج النصي (الملف التكميلي S3) إلى R ، والذي يحدد دالة تسمى "analearn."
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تعريف الوظيفة هو: analearn <- function (nboot = 10,000 ، naivelevel = 'N' ، refmutation = NA ، datname = NA ، header = TRUE ، seed = NA ، writeoutput = TRUE).
   2. ابدأ الوظيفة بإدخال "analearn()" في سطر أوامر R وتحديد ملف البيانات المراد تحليله (تم إنتاجه في الخطوة 8.3) عبر النافذة المنبثقة.
   3. اختر الطفرة المرجعية ، وهي النمط الجيني للتحكم ، عن طريق إدخال الرقم المقابل والضغط على enter.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بعد تحديد النمط الجيني المرجعي ، يستغرق البرنامج النصي عدة ثوان لإجراء 10,000 تكرار تمهيد.
   4. لاحظ جدول المخرجات (الجدول 3) ، الذي يحتوي على النمط الجيني ، وحالة التعلم (أي التعلم ، أو STM ، أو LTM) ، ومتوسط CI الساذج ، ومتوسط CI المدرب ، LI ، والفرق بين LI للتحكم مقارنة بالحالة التجريبية (LI dif) ، والحد الأدنى (LL) والحد الأعلى (UL) لفاصل الثقة 95٪ من LI dif ، وتشير قيمة p إلى احتمال عدم وجود فرق كبير.
      NOTE: سيقوم analearn بتخزين ملف نصي إخراج في الدليل حيث يوجد ملف البيانات. ومع ذلك، يظهر جدول الإخراج أيضا في وحدة تحكم R-Studio. يتم إنشاء الاسم الافتراضي استنادا إلى اسم ملف البيانات المقدم.
   5. هناك العديد من الوسيطات في الدالة analearn التي يمكن استخدامها لتغيير الإعدادات الافتراضية للوظيفة لضبط معلمات bootstrapping.
      NOTE: يحدد "nboot" عدد النسخ المتماثلة للتمهيد ويتم تعيينه على 10,000 افتراضيا. يمكن تغيير هذه القيمة إلى أي رقم صحيح أكبر من الصفر. يتضمن الجدول 5 العديد من الوسيطات التي يمكن استخدامها لتغيير الإعدادات الافتراضية للوظيفة. ومع ذلك، لا يوصى باستخدام البيانات التي يتم إنتاجها بعدد قليل من النسخ المتماثلة للتمهيد.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
<فئة قوية = "xfig">الشكل 1: تحديد مؤشر الخطوبة ونظرة عامة تجريبية. (أ) صور تظهر سلوك مغازلة ذكوري نمطي تجاه أنثى ذبابة. يتم عرض مراحل مختلفة من سلوك الخطوبة: الاتجاه (I) ، التالي (II) ، اهتزاز الجناح (التمديد) والتنصت (III) ، اللعق (IV) ، ومحاولة الجماع (V). (ب) نظرة عامة تخطيطية لأوقات التدريب والاختبار بالنسبة لدورة إضاءة الحاضنة ، محددة بالساعات. يشار إلى أوقات التدري...

المواد