هذا البروتوكول هو مقتطف من Qiang et al. ، اختبار الحفر / النفق للكشف عن نقص الأكسجة في ذبابة الفاكهة ميلانوجاستر يرقات ، J. Vis. Exp. (2018).
< p class = "jove_title" >
1. تحضير اليرقات
- قبل يومين أو أكثر من بدء الفحص ، قم بإعداد تقاطعات من المجموعات التجريبية والتحكم المرغوبة (20 أنثى على الأقل و 10 ذكور لكل منهما) في أطباق وضع البيض كما وصفها Wieschaus و Nusslein-Volhard ولكن باستخدام أكواب 50 مل من مادة البولي بروبيلين وأطباق بتري التي تستخدم لمرة واحدة 6.0 سم والتي تحتوي على أجار العنب وملطخة بمعجون الخميرة قبل الاستخدام مباشرة. احتفظ بالذباب في أطباق وضع البيض في الظلام في درجة حرارة الغرفة لحين الحاجة.
- وصفة أجار العنب - يمزج 100 مل من عصير العنب المركز المجمد بنسبة 100٪ ، و 350 مل من الماء منزوع اليوين ، و 5 مل من الخليك الجليدي و 13 جم D. melanogaster agar في دورق زجاجي سعة 1 لتر. الميكروويف على دفعات 1-2 دقيقة ، مع التحريك بين رشقات نارية ، حتى يذوب أجار بالكامل. قم بتبريد المحلول لبضع دقائق ثم أضف 10 مل من 10٪ (وزن / حجم) من Nipagen (methyl-p-hydroxybenzoate) في 95٪ إيثانول. امزج ، ثم ماصة 7 مل لكل طبق في أطباق بتري 6.0 سم التي يمكن التخلص منها ، واتركها حتى تجف في درجة حرارة الغرفة لمدة 3-4 ساعات. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية في أكياس بلاستيكية.
- وصفة معجون الخميرة - 7 جرام خميرة مجففة ، 10 مل ماء منزوع الأيونات ، تخلط بملعقة حتى يصبح قوامها متجانسا.
- مجموعات البيض الموقوتة لتوليد اليرقات التجريبية والسيطرة. باستخدام أطباق العنب الجديدة الملطخة بالخميرة ، اجمع البيض في درجة حرارة الغرفة لمدة 4 ساعات في الظلام خلال ساعات الصباح. قم بإزالة ألواح التجميع هذه لمدة 4 ساعات واستبدلها بأطباق جديدة. احتضان ألواح التجميع لمدة 4 ساعات طوال الليل عند 25 درجة مئوية حتى بعد ظهر اليوم التالي ، عندما تفقس معظم اليرقات. اجمع هذه اليرقات الأولى واستخدمها لإعداد التجربة.
2. إعداد لوحات الفحص
- تحضير لوحات الفحص. لتشغيل واحد من الفحص ، قم بإعداد خمس لوحات فحص لكل من 10 يرقات تجريبية وخمس لوحات من 10 يرقات تحكم. استخدم حفار الفلين مقاس 1.5 سم لإزالة قلب مركزي من الأجار من كل طبق ، مما يؤدي إلى إنشاء ثقب للطعام. ضعي معجون الخميرة (0.8 - 0.9 جم) في الحفرة واتركيه برفق بملعقة لعمل كومة تملأ الحفرة.
- تحضير طبق أجار - يمزج 700 مل من الماء منزوع الأيونات مع 16 جم من أجار D. melanogaster في دورق زجاجي سعة 2 لتر وميكروويف لمدة 5 دقائق. أضف 17.5 مل من 10٪ (وزن / حجم) Nipagen في 95٪ من الإيثانول ، واخلطه ، ثم استمر في تسخين الميكروويف على دفعات 30 ثانية متبوعا بالتحريك ، حتى يذوب كل أجار تماما. تبرد لمدة دقيقة أو دقيقتين ، ثم ضع الماصة 15 مل في أطباق بتري بلاستيكية مقاس 10 سم. اترك أجار بالهلام ، وقم بتغطية الأطباق بأغطية واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة لبضع ساعات أو طوال الليل. قم بتخزين الأطباق في أكياس بلاستيكية محكمة الغلق عند 18 درجة مئوية < br / >
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة 1: لتجنب تكوين بلورات Nipagen على سطح الألواح بسبب الجفاف الزائد ، استخدم الألواح في غضون أيام قليلة من التحضير. إذا لزم الأمر ، يمكن إعادة إذابة البلورات عن طريق إسقاط بضعة ميكرولترات من الكحول بنسبة 95٪ عليها.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة 2: يمكن أن يكون لدفعات الأجار خصائص تبلور مختلفة. يجب أن تكون ألواح الجل الجافة صلبة الملمس ومرنة بدرجة كافية بحيث يمكن إزالة دائرة نظيفة وسليمة من الأجار عند استخدام حفار الفلين لإنشاء ثقب الطعام (انظر أعلاه).
- إعداد اليرقات في لوحات الفحص. استخدم الضغط الميكانيكي لمنحنى طرف ملعقة بلاستيكية وغمس الطرف في عجينة الخميرة لتوفير "مادة لاصقة" لالتقاط اليرقات. التقط يرقات الطور الأول بشكل فردي وضعها على طبق أجار بالقرب من كومة الطعام. قم بإعداد ما لا يقل عن خمس صفائح مكررة من 10 يرقات لكل من الأنماط الجينية التجريبية والضابطة. بمجرد الانتهاء ، قم بتغطية كل لوحة وتسميتها واضبط الألواح (جانب الغطاء لأعلى) في مكان مظلم في درجة حرارة الغرفة (في مختبرنا هذه 22 درجة مئوية).
< p class = "jove_title" >
3. مراقبة لوحات الفحص
- افحص الأطباق يوميا تحت مجهر تشريح وسجل عدد اليرقات فوق الطعام أو على سطح الأجار. لاحظ أي يرقات ميتة أو محتضرة مرئية. لاحظ متى وما إذا كان ينظر إلى النفق في الطبقة السفلية من الأجار عندما تنتقل اليرقات إلى الطور الثالث. لاحظ التواريخ التي تبدأ فيها الشرانق في التكون ولاحظ أي تشوهات في العذراء. استمر في الملاحظات اليومية حتى تموت جميع اليرقات أو تتشرنق.
- قم بإزالة الشرانق بعناية من الطبق بإبرة إغاظة مثنية وانقلها إلى طبق العنب. إذا رغبت في ذلك ، استمر في مراقبة الشرانق لتحديد عدد الشرانق القريبة كبالغين.
