ذبابة الفاكهة تشريح القرص الخيالي لليرقة: طريقة لمراقبة الظهارة النامية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Morimoto ، K. and Tamori ، Y. تحريض وتشخيص الأورام في ذبابة الفاكهة القرص الخيالي الظهارية. J. Vis. Exp. (2017).

عند تلطيخ ذبابة الفاكهة الأقراص الخيالية ، غالبا ما يتم إجراء تشريح تقريبي حيث تتعرض الأقراص ولكنها تظل متصلة بالجسم. بمجرد تلطيخها ، يتم عزل الأقراص ذات الأهمية وتركيبها. يوضح بروتوكول المثال إجراء لتشريح القرص التخيلي للجناح وتركيبه.

البروتوكول

< p class = "jove_content"> هذا البروتوكول هو مقتطف من Morimoto و Tamori ، تحريض وتشخيص الأورام في ذبابة الفاكهة القرص الخيالي الظهارة ، J. Vis. Exp. (2017).

< ص الفئة = "jove_title" >1. تشريح اليرقات

1. اجمع يرقات الطور الثالث المتجولة بعصا خشبية أو ملقط حاد ، وقم بتصنيفها الجيني بواسطة علامات الفلورسنت المناسبة (على سبيل المثال ، EGFP) تحت مجهر مجسمة مضان وضعها في طبق تشريح مع PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
2. اغسل اليرقات في PBS عن طريق سحب العينات باستخدام ماصات نقل البلاستيك سعة 2 مل.
3. اقرص مركز اليرقة بملقط واحد وقم بتمزيق الجسم إلى نصفين بالملقط الآخر.
4. اضغط على خطاف الفم من النصف الأمامي ملقط واحد وادفع الفم نحو الجسم بالملقط الآخر لقلب الجسم من الداخل إلى الخارج.
5. قم بإزالة المواد غير الضرورية مثل الغدد اللعابية أو الأجسام الدهنية باستخدام الملقط.

فئة

2. التثبيت وتلوين الأجسام المضادة

1. انقل النصف الأمامي المفصل من جسم اليرقات (بما في ذلك أقراص الجناح الخيالية) إلى أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل وقم بإصلاحه في 1 مل من محلول الإصلاح (4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع دوران لطيف.
   أنذر: الفورمالديهايد سام وله إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: في هذا الجزء ، تتم جميع الخطوات على المغذي في درجة حرارة الغرفة في الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك.
2. قم بإزالة محلول Fix وتجاهله. اغسل المناديل ب 1 مل من PBT (0.3٪ Triton X-100 في PBS) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها.
3. قم بإزالة PBT وأضف 1 مل من PBTG (0.2٪ ألبومين مصل بقري و 5٪ مصل ماعز عادي في PBT) للحجب وتناول 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإزالة PBTG وأضف محلول الجسم المضاد الأولي المخفف بشكل مناسب باستخدام PBTG (انظر جدول المواد) وقم بتسخينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الأنسجة ب 1 مل PBT ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها.
6. قم بإزالة PBT وإضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف بشكل مناسب باستخدام PBTG (1: 400). يسكب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل الأنسجة ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
8. لتلطيخ F-actin ، قم بإزالة PBT وإضافة محلول Phalloidin المخفف بشكل مناسب في PBS (1:40). ثم قم بتسخينه لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة محلول الفالودين واغسل المناديل ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
9. لمواجهة الحمض النووي النووي ، قم بإزالة PBT وإضافة محلول DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) (0.5 ميكروغرام / مل من DAPI في PBS). ثم نوتات 10 دقائق < / > أنذر: DAPI لديه إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد.
10. قم بإزالة محلول DAPI واغسل المناديل ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
11. اشطف مرة واحدة في 1 مل من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
12. قم بإزالة PBS وأضف 500 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ كوسيط التركيب المسبق.

< p class = "jove_title" >3. التركيب على شرائح المجهر

1. ضع الأنسجة الملطخة على شريحة مجهرية باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 2 مل.
2. انقل الأنسجة إلى قطرات من وسط التركيب على شريحة مجهر أخرى باستخدام ملقط.
3. اضغط باستمرار على نهاية الأنسجة التشريح ملقط واحد واسحب أقراص هوائيات الدماغ والعين بالملقط الآخر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: احتفظ بالأدمغة المقطوعة لوضعها بالقرب من الأقراص الخيالية للجناح. تعمل الأدمغة كمنصة تمنع الغطاء من سحق الأقراص الخيالية للجناح.
4. لعزل الأقراص الخيالية للجناح ، اضغط على نهاية الأنسجة المقطعة ملقطا واحدا وخدش جدار الجسم برفق وقم بتمزيق الأقراص بالملقط الآخر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا كان من الصعب العثور على أقراص خيالية للجناح ، فقم بتقشير القصبة الهوائية من الجانب الخلفي إلى الجانب الأمامي. تلتصق الأقراص الخيالية للجناح بالقصبة الهوائية.
5. قم بتغطية الأقراص الخيالية برفق بغطاء وختم بطلاء الأظافر ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

المواد