ذبابة الفاكهة تشريح القرص الخيالي لليرقة: طريقة لمراقبة الظهارة النامية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Morimoto ، K. and Tamori ، Y. تحريض وتشخيص الأورام في ذبابة الفاكهة القرص الخيالي الظهارية. J. Vis. Exp. (2017).

عند تلطيخ ذبابة الفاكهة الأقراص الخيالية ، غالبا ما يتم إجراء تشريح تقريبي حيث تتعرض الأقراص ولكنها تظل متصلة بالجسم. بمجرد تلطيخها ، يتم عزل الأقراص ذات الأهمية وتركيبها. يوضح بروتوكول المثال إجراء لتشريح القرص التخيلي للجناح وتركيبه.

البروتوكول

< p class = "jove_content"> هذا البروتوكول هو مقتطف من Morimoto و Tamori ، تحريض وتشخيص الأورام في ذبابة الفاكهة القرص الخيالي الظهارة ، J. Vis. Exp. (2017).

< ص الفئة = "jove_title" >1. تشريح اليرقات

1. اجمع يرقات الطور الثالث المتجولة بعصا خشبية أو ملقط حاد ، وقم بتصنيفها الجيني بواسطة علامات الفلورسنت المناسبة (على سبيل المثال ، EGFP) تحت مجهر مجسمة مضان وضعها في طبق تشريح مع PBS (محلول ملحي مخزن بالفوسفات).
2. اغسل اليرقات في PBS عن طريق سحب العينات باستخدام ماصات نقل البلاستيك سعة 2 مل.
3. اقرص مركز اليرقة بملقط واحد وقم بتمزيق الجسم إلى نصفين بالملقط الآخر.
4. اضغط على خطاف الفم من النصف الأمامي ملقط واحد وادفع الفم نحو الجسم بالملقط الآخر لقلب الجسم من الداخل إلى الخارج.
5. قم بإزالة المواد غير الضرورية مثل الغدد اللعابية أو الأجسام الدهنية باستخدام الملقط.

فئة

2. التثبيت وتلوين الأجسام المضادة

1. انقل النصف الأمامي المفصل من جسم اليرقات (بما في ذلك أقراص الجناح الخيالية) إلى أنبوب بلاستيكي سعة 1.5 مل وقم بإصلاحه في 1 مل من محلول الإصلاح (4٪ فورمالديهايد في PBS) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة في الظلام مع دوران لطيف.
   أنذر: الفورمالديهايد سام وله إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: في هذا الجزء ، تتم جميع الخطوات على المغذي في درجة حرارة الغرفة في الظلام ما لم يذكر خلاف ذلك.
2. قم بإزالة محلول Fix وتجاهله. اغسل المناديل ب 1 مل من PBT (0.3٪ Triton X-100 في PBS) ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها.
3. قم بإزالة PBT وأضف 1 مل من PBTG (0.2٪ ألبومين مصل بقري و 5٪ مصل ماعز عادي في PBT) للحجب وتناول 1 ساعة في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
4. قم بإزالة PBTG وأضف محلول الجسم المضاد الأولي المخفف بشكل مناسب باستخدام PBTG (انظر جدول المواد) وقم بتسخينه طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
5. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الأساسي واغسل الأنسجة ب 1 مل PBT ثلاث مرات لمدة 15 دقيقة لكل منها.
6. قم بإزالة PBT وإضافة محلول الأجسام المضادة الثانوية المخفف بشكل مناسب باستخدام PBTG (1: 400). يسكب لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة أو طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
7. قم بإزالة محلول الأجسام المضادة الثانوية واغسل الأنسجة ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
8. لتلطيخ F-actin ، قم بإزالة PBT وإضافة محلول Phalloidin المخفف بشكل مناسب في PBS (1:40). ثم قم بتسخينه لمدة 20 دقيقة. قم بإزالة محلول الفالودين واغسل المناديل ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
9. لمواجهة الحمض النووي النووي ، قم بإزالة PBT وإضافة محلول DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) (0.5 ميكروغرام / مل من DAPI في PBS). ثم نوتات 10 دقائق < / > أنذر: DAPI لديه إمكانات مسرطنة. ارتد قفازات واقية وملابس لمنع ملامسة الجلد.
10. قم بإزالة محلول DAPI واغسل المناديل ب 1 مل من PBT مرتين لمدة 15 دقيقة لكل منهما.
11. اشطف مرة واحدة في 1 مل من PBS لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
12. قم بإزالة PBS وأضف 500 ميكرولتر من الجلسرين بنسبة 100٪ كوسيط التركيب المسبق.

< p class = "jove_title" >3. التركيب على شرائح المجهر

1. ضع الأنسجة الملطخة على شريحة مجهرية باستخدام ماصة نقل بلاستيكية سعة 2 مل.
2. انقل الأنسجة إلى قطرات من وسط التركيب على شريحة مجهر أخرى باستخدام ملقط.
3. اضغط باستمرار على نهاية الأنسجة التشريح ملقط واحد واسحب أقراص هوائيات الدماغ والعين بالملقط الآخر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: احتفظ بالأدمغة المقطوعة لوضعها بالقرب من الأقراص الخيالية للجناح. تعمل الأدمغة كمنصة تمنع الغطاء من سحق الأقراص الخيالية للجناح.
4. لعزل الأقراص الخيالية للجناح ، اضغط على نهاية الأنسجة المقطعة ملقطا واحدا وخدش جدار الجسم برفق وقم بتمزيق الأقراص بالملقط الآخر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا كان من الصعب العثور على أقراص خيالية للجناح ، فقم بتقشير القصبة الهوائية من الجانب الخلفي إلى الجانب الأمامي. تلتصق الأقراص الخيالية للجناح بالقصبة الهوائية.
5. قم بتغطية الأقراص الخيالية برفق بغطاء وختم بطلاء الأظافر ؛ قم بتخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات الكواشف محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) واكو 162-19321 تريتونإكس-100 واكو 168-11805 فورمالدهيد واكو 064-00406 ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 7906 مصل الماعز العادي سيغما جي 6767 تركيب الوسط ، Vectashield مختبرات ناقلات إتش -1000 دابي سيغما د9542 الماوس المضاد ل Dlg 4F3 دراسات التطور بنك الورم الهجين 4F3 المضادة للأقراص كبيرة ، RRID: AB_528203 خفف في PBTG ، 1:40 الماوس المضاد ل MMP1 دراسات التطور بنك الورم الهجين 3A6B4 ، RRID: AB_579780 3 مختلطة 1: 1: 1 وتخفف في PBTG ، 1:40 الماوس المضاد ل MMP1 دراسات التطور بنك الورم الهجين 3B8D12 ، RRID: AB_579781 3 مختلطة 1: 1: 1 وتخفف في PBTG ، 1:40 الماوس المضاد ل MMP1 دراسات التطور بنك الورم الهجين 5H7B11 ، RRID: AB_579779 3 مختلطة 1: 1: 1 وتخفف في PBTG ، 1:40 الفأر المضاد للأتوبولين دراسات التطور بنك الورم الهجين AA4.3 ، RRID: AB_579793 تمييع في PBTG ، 1:100 أليكسا فلور 546 فالودين المجسات الجزيئية أ22283 تمييع في PBS ، 1:40 الماعز المضاد للفأر IgG ، Alexa Fluor 546 المجسات الجزيئية أ 11030 تمييع في PBTG ، 1: 400 سلالات الذباب sd-Gal4 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #8609 أعيد دمجها مع UAS-EGFP upd-Gal4 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #26796 أعيد دمجها مع UAS-EGFP UAS-lgl-RNAi مركز فيينا ذبابة الفاكهة RNAi #51247 UAS-scrib-RNAi مركز فيينا ذبابة الفاكهة RNAi #105412 UAS-RASV12 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #64196 UAS-Yki3SA مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #28817 hsFLP مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة # 6 Act>CD2>GAL4 (قابل للطي GAL4) مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #4780 أعيد دمجها مع UAS-EGFP UAS-EGFP مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #5428 كروموسوم X UAS-EGFP مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #6658 الكروموسوم الثالث UAS-Dicer2 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #24650 الكروموسوم الثاني UAS-Dicer2 مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة #24651 الكروموسوم الثالث في كج-جي إف بي مورين وآخرون 2001 مصيدة البروتين GFP