هذا البروتوكول هو مقتطف من Immarigeon et al. ، بروتوكول قائم على FACS لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا الثانوية لذبابة الفاكهة الغدد الذكرية الملحقة، J. Vis. Exp. (2019).
< p class = "jove_title" >1. الحلول وإعداد المواد
- تحضير الحلول التالية.
- تحضير الوسط المكملي بالمصل (SSM): وسط ذبابة الفاكهة من شنايدر مكمل بمصل بقري جنيني معطل بالحرارة بنسبة 10٪ و 1٪ بنسلين ستربتومايسين.
- قم بإعداد كميات من إنزيم التربسين 1x (على سبيل المثال ، إنزيم TrypLE Express) وتخزينها في درجة حرارة الغرفة.
- تحضير كميات من غراء [50 وحدة / مل] (مخزنة عند -20 درجة مئوية وتذوب مرة واحدة فقط).
- تحضير 1x محلول ملحي عازل للفوسفات (PBS ، مخزن في درجة حرارة الغرفة).
- قم بإعداد أطراف ماصة متعددة مستديرة اللهب للتفكك المادي للغدد الملحقة.< / >
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: استخدم نصائح منخفضة الاحتباس للتعامل مع الغدد الملحقة لأنها تميل إلى الالتصاق بالبلاستيك غير المعالج. تقلل عملية تقريب اللهب من فتحة الطرف وتنعيم حواف الحافة. هذا يضمن تفككا فعالا بعد هضم الببتيداز دون قص أغشية الخلايا.
- قم بقص طرف واحد سعة 200 ميكرولتر بشفرة حادة وقم بتمريره برفق فوق اللهب لإكمال طرفه بحيث تكون الفتحة أوسع ولكنها سلسة للتعامل معها أثناء الخطوة 2.7.
- قم بتضييق فتحة أطراف متعددة سعة 1,000 ميكرولتر عن طريق تمرير فتحة الطرف بالقرب من اللهب لمدة تقل عن ثانية واحدة. قم بتدوير الطرف قليلا لتجنب الإفراط في الذوبان أو الانسداد. فرز النصائح المصنوعة من أضيق إلى أوسع. يمكن القيام بذلك عن طريق توقيت سرعة الشفط. حاول فصل عينة صغيرة الحجم من AGs لاختبار كفاءة أضيق النصائح.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: هذه النصائح ضرورية للتحريض الميكانيكي. تسمح أطراف الماصات عالية الجودة المستديرة باللهب بالتفكك الكامل مع الحفاظ على بقاء الخلية. على هذا النحو ، يتم غسل هذه النصائح جيدا بالماء في نهاية الإجراء لإعادة الاستخدام. هذا يسمح بالتفكك القابل للتكرار يوما بعد يوم.
2. تشريح الغدد الملحقة
- ضع 20 إلى 25 ذكرا ذبابة الفاكهة في طبق زجاجي على الثلج.
- تشريح 1 ذكر في SSM. خلع الجهاز التناسلي ومسح زوج الغدة الملحقة من جميع الأنسجة الأخرى بصرف النظر عن قناة القذف.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قم بإزالة الخصيتين لأن المنوية التي تم إطلاقها يمكن أن تخلق كتلات وتزعج عملية التفكك. قم بإزالة لمبة القذف ، مما يجعل التعامل معها صعبا عندما تطفو.
- باستخدام الملقط ، انقل الغدد الملحقة إلى صفيحة زجاجية مملوءة ب SSM في درجة حرارة الغرفة. كرر الخطوات 2.2-2.3 20 مرة للحصول على دفعة من 20 زوجا من الغدد في SSM.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: سيتم تحقيق هذه الخطوات في غضون 15 إلى 20 دقيقة. يجب أن تبدو AGs صحية ، ويجب أن تكون الحركات التمعجية لطبقة العضلات حول الغدد مرئية. يمكن مراقبة GFP باستخدام مجهر الفلورسنت.
- انقل الغدد الملحقة إلى 1x PBS لغسل لمدة 1-2 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لتحسين التفكك ، من الضروري شطف الغدد باستخدام PBS. ومع ذلك ، يجب أن تكون مدة هذه الخطوة محدودة حيث تظهر الخلايا علامات الإجهاد في PBS. تنتفخ الخلايا الثانوية المنفصلة في PBS وتموت بسرعة.
- قم بتخفيف 20 ميكرولتر من الغراء [50 وحدة / مل] إلى 180 ميكرولتر من إنزيم التربسين 1x للحصول على محلول التفكك (لتوسيع نطاق أو تقليل احتفظ ب 9 ميكرولتر من إنزيم التربسين و 1 ميكرولتر من غراء لكل ذكر). باستخدام الملقط ، انقل الغدد الملحقة إلى هذا الحل.
- اعزل طرف الغدد الملحقة (التي تحتوي على خلايا ثانوية) عن الجزء القريب. استخدم ملقطا دقيقا لضغط منتصف الفص الغدي بإحكام وقطعه بطرف حاد من ملقط ثان. قم بإزالة الجزء القريب من الغدد الملحقة وقناة القذف لتحسين التفكك وتقليل وقت فرز الخلايا.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: سيستغرق تشريح الجزء البعيد من 20 زوجا من الغدد من 15 إلى 20 دقيقة ، وبالتالي سيبدأ الهضم بواسطة الببتيدات في درجة حرارة الغرفة.
بعد تشريح - جميع أطراف الغدة، انقلها إلى أنبوب سعة 1.5 مل باستخدام طرف ماصة خاص سعة 200 ميكرولتر تم إعداده في الخطوة 1.2.1. يجب أن تكون عريضة ومستديرة ورطبة قبل التعامل مع الغدد.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لسحب أنسجة الغدة الملحقة ، يجب دائما أن تكون الأطراف مبللة مسبقا بالمحلول المناسب (إنزيم التربسين أو SSM ، احتفظ بأنبوب واحد من كل منها لهذا الغرض). اشطف الأطراف بعناية بين العينات لتجنب التلوث.