فحص الجزيرة: طريقة عالية الإنتاجية لتقييم السلوك الحركي ذبابة الفاكهة

الملخص

المصدر: Eidhof، I.، et al. تحليل عالي الإنتاجية للسلوك الحركي في فحص جزيرة ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو اختبار الجزيرة ، وهي طريقة سلوكية تستخدم لدراسة ذبابة الفاكهة الحركة. يتميز نموذج البروتوكول بإعداد للمقايسة المتوافق مع تحليل الصور شبه الآلي.

البروتوكول

< p class = "jove_content">هذا البروتوكول هو مقتطف من Eidhof et al. ، تحليل عالي الإنتاجية للسلوك الحركي في مقايسة جزيرة ذبابة الفاكهة ، J. Vis. Exp. (2017).

< p class = "jove_title" >1. بناء صندوق فحص الجزيرة

1. قم بإعداد صينية مصنوعة من مادة قوية ، مثل بولي ميثيل ميثاكريلات (PMMA) ، لتحتوي على طبقة من الماء (أي حمام). تأكد من أن المادة ليست بيضاء.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يوصى بأبعاد 40 × 35 × 2.5 سم³ (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
2. قم بإعداد صندوق (42 × 38 × 25 سم³) مصنوع من مادة قوية وشفافة ، مثل PMMA ، ليتم وضعه حول الحمام لمنع الذباب من الهروب إلى مساحة المختبر. ضع ثقبا (20 × 30 سم²) على الجانب الجانبي كبير بما يكفي للمجرب للتعامل بسهولة مع القوارير مع الذباب وإسقاطها على الجزيرة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
3. قم بإعداد منصة مرتفعة بأبعاد 10 × 15 × 2.5 سم³ ، مصنوعة من مادة غير منفذة (PMMA أو بلاستيك) مانعة للماء.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يكون لهذه المنصة سطح أبيض موحد لضمان تباين جيد لتحليل الصور. الحجم ليس ثابتا بالضرورة ، ولكن يجب أن يكون كبيرا بما يكفي للتأكد من أن جميع الذباب يهبط في البداية على المنصة والحصول على فرصة للمشي عليه (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
4. قم بإصلاح المنصة إما عن طريق لصقها في الحمام أو وضع الأوزان أو الأشياء الثقيلة الأخرى داخل صندوق المنصة لمنع التغييرات الموضعية للمنصة أثناء جلسة التجربة / التصوير.

2. متطلبات البرنامج والتثبيت

1. تركيب برنامج تسجيل الصور.
   1. قم بتنزيل برنامج تسجيل الصور لتسجيل سلسلة صور الجزيرة (انظر جدول المواد) وتثبيت البرنامج على جهاز كمبيوتر.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: برنامج تسجيل التصوير الموضح في هذا البروتوكول مدعوم فقط من قبل Windows. تمت إضافة بديل للمستخدمين الآخرين إلى جدول المواد.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الذباب المراد اختباره في فحص الجزيرة

1. جمع الذباب المرحلي لكل حالة تجريبية تحت التخدير البارد أو ثاني أكسيد الكربون (CO₂) ، كما هو موضح سابقا (على مدى 1-2 يوم).
   1. قم بإعداد ما لا يقل عن 3 قوارير عينة لكل حالة تجريبية ، تحتوي كل منها على ما يقرب من 15 ذبابة تم تنظيمها. استخدم فقط الذباب ذو الأجنحة السليمة والتي من نفس العمر والجنس.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة للتجارب الموضحة هنا ، 5 قوارير عينة تحتوي على 15 ذبابا ذكرا من الأنماط الجينية w^-; Actin-Gal4 /+ (التحكم) و w^-; تم جمع Actin-Gal4 / GD11950 (tefu RNAi) في يوم الإغلاق ، وعمرها 4 أيام ، واستخدمت لإجراء فحص الجزيرة. تم الحصول على RNAi ، وسلالات التحكم ، وسائق Actin-gal4 من مصدر تجاري (انظر جدول المواد).
2. دع الذباب يتعافى لتجنب آثار التخدير (يوم واحد على الأقل عند استخدام ثاني أكسيد الكربون₂) قبل اختبار الذباب الذي تم جمعه في فحص الجزيرة في سن الاهتمام.

4. الإعداد التجريبي

< strong class = "note" >ملاحظة: انظر الشكل 1ب.

1. أضف الماء البارد مع كمية صغيرة من الصابون إلى صينية الحمام وضع المنصة في المنتصف.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يقلل الصابون من التوتر السطحي للماء ؛ الذباب الذي يلمس الماء سوف يغرق. هذا يمنع زيادة كميات الذباب التي تطير في الصندوق أثناء تقدم الجلسة التجريبية.
2. ضع الصندوق الشفاف أعلى الدرج وقم بإضاءة المنصة من الأعلى باستخدام مصباح.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إضاءة النظام الأساسي مطلوبة بشكل أساسي لضمان تباين الفيديو المناسب. مصباح LED عادي بجهد 12 فولت مناسب لهذا الغرض.
3. ضع كاميرا الويب مباشرة فوق المنصة (خارج الصندوق) وقم بتوصيلها بجهاز كمبيوتر.
4. قم بإنشاء مجلدات جديدة على الكمبيوتر لتخزين البيانات التجريبية المختلفة قبل التجارب.
   1. اتبع بنية المثال الموضح في الشكل 2أ لإنشاء المجلدات. على سبيل المثال ، إذا كان التصميم التجريبي يتطلب اختبار نمطين وراثيين بخمس نسخ مكررة لكل منهما ، فقم أولا بإنشاء مجلد رئيسي يحتوي على تاريخ التجربة. داخل المجلد الرئيسي ، قم بإنشاء مجلدين فرعيين (واحد لكل نمط جيني). داخل مجلدات النمط الجيني ، قم بإنشاء خمسة مجلدات فرعية جديدة ، واحد لكل نسخ متماثل.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لمزيد من التحليل ، من الضروري حفظ سلسلة الصور المقابلة للتجارب الفردية في مجلدات بأسماء فريدة.

5. إعداد إعدادات الفيديو في قسم "جهاز الالتقاط" في الواجهة

1. افتح برنامج تسجيل الصور ، وضمن علامة التبويب "التقاط" ، انقر فوق "صور الفاصل الزمني ..." وحدد كاميرا الويب المناسبة ك "جهاز الالتقاط".
2. ضع ذبابة ميتة على الجزيرة ؛ اضبط إعدادات الفيديو بالنقر فوق مربع "إعدادات الفيديو". قم بالتمرير عبر أشرطة الأدوات ، واضبط السطوع والتباين واللون بطريقة تظهر الذبابة الميتة باللون الأسود على خلفية بيضاء (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب). عند اكتمال التعديلات ، انقر فوق "موافق".

6. إعداد إعدادات التسجيل وحفظ الفيديو في قسم "الفاصل الزمني" من الواجهة

1. اضبط الإعدادات في "إعداد فيلم اللقطات المتتابعة" لحفظ التجربة كملف .avi. انقر فوق "تصفح ..."، وحدد الدليل الذي سيتم تخزين الفيلم فيه، وحدد اسم الفيديو، واضغط على "حفظ".
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لا يستخدم ملف الفيديو لقياس البيانات كميا. ومع ذلك ، قد يكون من المفيد الحصول على فكرة عامة عن التجربة.
2. اضبط الإعدادات في قسم "إعداد فيلم اللقطات المتتابعة".
   1. في مربع الضغط ، حدد "Intel IYUV code" لضغط الفيديو واختر "خذ إطارا واحدا كل 0.1 ثانية" ، مع "معدل التشغيل (الصور في الثانية):" عند 10.
   2. احفظ السلسلة الزمنية للتجربة كإطارات .bmp بالنقر فوق "خيارات متقدمة ..." حدد "إنشاء صورة .bmp لكل إطار تم التقاطه". انقر فوق "تصفح". حدد نفس الدليل في نافذة "أثناء التقاط فيلم AVI" (كما هو محدد في الخطوة 6.1) ، وانقر فوق "فتح" ، واضغط على "موافق" .
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لاحظ أنه أثناء التجربة ، يتم تخزين الإطارات كملفات .bmp (مطلوبة لتحليل البيانات). يسمي البرنامج الإطارات باسم "A" متبوعا بالرقم المقابل لتسلسل التقاط الإطار (على سبيل المثال ، "A_number.bmp") (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ج). احفظ دائما الصور التي تنتمي إلى تجارب مختلفة في مجلد جديد لضمان عدم الكتابة فوق سلسلة الصور المسجلة مسبقا. اعلم أنه لا يتم حفظ الصور تلقائيا في نفس المجلد مثل ملف الفيديو ما لم يتم تحديد هذا المجلد ضمن "تصفح ..." عند النقر فوق مربع "خيارات متقدمة".

7. فحص الجزيرة وجمع البيانات

1. اضغط على زر البدء في واجهة صورة اللقطات المتتابعة لبرنامج تسجيل الصور لبدء التسجيل.
2. اضغط على القارورة التجريبية التي تحتوي على الذباب (الخطوة 3) 2-3 مرات للتأكد من وجود الذباب في قاع القارورة. قم بإزالة قابس القارورة بسرعة ، وبحركة قوية ، اضغط على القارورة الموجودة على المنصة حتى تسقط جميع الذباب على المنصة في نفس الوقت (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ج).
3. بعد حوالي 30 ثانية ، اضغط على زر "إيقاف" لإيقاف التسجيل.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا اختفت جميع الذباب من المنصة ، فيمكن إيقاف التسجيل في وقت مبكر.
4. قم بإزالة الذباب المتبقي لمدة 30 ثانية على المنصة يدويا بعد إيقاف تسجيل الصورة.
5. قبل الشروع في تسجيل التجربة التالية ، قم بتغيير الدليل المستهدف لملفات .bmp والأفلام (انظر القسم 6).

النتائج

p class = "jove_content" >
الشكل 1: مخطط انسيابي يحدد المتطلبات والإجراءات التجريبية وتحليل مقايسة الجزيرة. (أ) معدات فحص الجزيرة. (ب) الإعداد التجريبي لمقايسة الجزيرة. (ج) فحص الجزيرة. (د) تجهيز بيانات فحص الجزيرة باستخدام المقياس الكلي "مقايسة ذبابة الفاكهة في الجزيرة". يتكون الماكرو "ذبابة الفاكهة المقايسة الجبهة" من 3 وحدات ماكرو فرعية: 1) إنشاء مكدس ...

المواد

<جدول fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="دائما"> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 25 × 95 ملم ذبابة الفاكهة قوارير فلاي ستاف 32-116 ساب - كاميرا ويب لوجيتك C525 HD لوجيتك - أي كاميرا ويب مع اتصال USB مناسبة. الوقوف لحمل كاميرا الويب - - - مصباح - - مصابيح LED 12 فولت مناسبة وسادة قصف - - أي لوحة ماوس تعمل صندوق فحص الجزيرة - - الأبعاد 40x35x2.5 سم. ثقب 20x30 سم شفاف. حمام فحص الجزيرة - - الأبعاد 42x38x25 سم غير أبيض. الجزيرة / المنصة - - الأبعاد 42 × 38 × 25 سم ، أبيض موحد. صابون - - منظف غسل الصحون القياسي مناسب. حاسوب - - يتم تشغيل البرامج النصية على كل من Windows و Mac برنامج تسجيل الصور: HandiAvi® AZcendant® - HandyAvi متوافق فقط مع Windows وقد تم وصفه في جميع أنحاء المخطوطة.
يمكن تنزيله من: http://www.azcendant.com/DownloadHandyAvi.html (الإصدار 5.0) برنامج تسجيل الصور: WebcamCapture - - المكون الإضافي Fiji / ImageJ الذي يمكن استخدامه على Mac بديل ل HandyAvi لتسجيلات الصور ويمكن تنزيله من:
https://imagej.nih.gov/ij/plugins/webcam-capture/
عند استخدام هذه الطريقة ، يجب على المستخدم استخدام نفس إعداد المجلد وإعدادات تسجيل الصور المشار إليها في هذه المخطوطة ،
باستثناء أنه لكل نسخ متماثل تجريبي، يجب تصدير مكدس الصور الملتقطة Stack.tiff إلى مجلد النسخ المتماثل
التجريبي المقابل.
عند تشغيل ماكرو "ذبابة الفاكهة المقايضة" على هذه البيانات، يجب ألا يكون هناك نص في إعداد "معرف الإطار الأول".