بروتوكول العمر الافتراضي لذبابة الفاكهة السوداء: توليد منحنيات البقاء على قيد الحياة لتحديد الاختلافات في طول عمر الذبابة

الملخص

المصدر: Bovier ، T. F. ، et al. طرق اختبار اضطراب الغدد الصماء في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2019).

يستخدم العلماء بروتوكول ذبابة الفاكهة لقياس كيفية تأثير الظروف التجريبية المختلفة على طول عمر الذباب وتوليد منحنيات البقاء على قيد الحياة في عملية تحديد النتائج التجريبية. يتميز بروتوكول العينة بالاختبار الذي يتم تطبيقه لدراسة التأثيرات على طول العمر من التعرض لتركيزات متفاوتة من المواد الكيميائية المسببة لاضطراب الغدد الصماء ، أو EDCs ، مثل 17-α-ethinylestradiol (EE2).

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Bovier et al. ، طرق اختبار اضطراب الغدد الصماء في ذبابة الفاكهة السوداء ، J. Vis. Exp. (2019).

< ص الفئة = "jove_title" >1. تحضير الطعام

1. للحفاظ على المخزون ونمو اليرقات ، استخدم وسط دقيق الذرة الذي يحتوي على 3٪ خميرة بودرة ، 10٪ سكروز ، 9٪ دقيق ذرة مطبوخ مسبقا ، 0.4٪ أجار ، ثم يسمى بعد ذلك وسط دقيق الذرة (CM).
   1. ضعي 30 جم من الخميرة في 100 مل من ماء الصنبور ، واتركيها تغلي واتركيها تغلي لمدة 15 دقيقة.
   2. بشكل منفصل ، اخلطي جيدا 90 جم من دقيق الذرة المطبوخ مسبقا ، و 100 غرام من السكر ، و 4 جم من الأجار في 900 مل من ماء الصنبور.
   3. يغلى المحلول في الغليان ، ويخفض الحرارة ويطهى لمدة 5 دقائق مع التحريك المستمر.
   4. بعد 5 دقائق ، أضيفي محلول الخميرة الساخنة واتركيها على نار هادئة لمدة 15 دقيقة أخرى.
   5. قم بإيقاف تشغيل مصدر الحرارة واترك المحلول يبرد إلى حوالي 60 درجة مئوية.
   6. أضف 5 مل / لتر من 10٪ ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات في الإيثانول ، واخلطه جيدا واتركه لمدة 10 دقائق < / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: كن حذرا مع كمية ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات ، نظرا لأن التركيز العالي من مبيدات الفطريات يمكن أن يكون قاتلا لليرقات.
   7. قم بتوزيع الوسيط في قوارير / زجاجات: 8 مل في كل قارورة ذبابة (25 مم × 95 مم) ، 3 مل في كل قارورة ذبابة (22 مم × 63 مم) و 60 مل في كل زجاجة ذبابة (250 مل).
   8. قم بتغطية القوارير بقطعة قماش قطنية واتركها تجف في درجة حرارة الغرفة (RT) لمدة 24 ساعة قبل التخزين.
   9. قم بمعايرة الاتساق الصحيح تجريبيا وترطيب CM عن طريق تعديل كمية الأجار المستخدمة و / أو أوقات التبريد / التجفيف.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: القوارير غير الموصولة والمعبأة والملفوفة مستقرة لمدة 15 يوما تقريبا عند 4 درجات مئوية.
2. بالنسبة للبالغين ذبابة الفاكهة ، استخدم وسيطا يحتوي على 10٪ خميرة بودرة ، 10٪ سكروز ، 2٪ أجار ، ويسمى بعد ذلك وسط البالغين (AM).
   1. اخلطي 10 جم من مسحوق الخميرة ، 10 جم من السكروز ، 2 جم من أجار في 100 مل من الماء المقطر.
   2. يغلى هذا الخليط مرتين ، بفاصل 3 دقائق ، أو حتى يذوب أجار ، باستخدام الميكروويف.
   3. بمجرد أن يبرد المحلول إلى 60 درجة مئوية ، أضف 5 مل / لتر من 10٪ ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات في الإيثانول ، واخلطه جيدا ووزعه في قوارير (10 مل لكل قارورة).
   4. غطي القوارير بقطعة قماش قطنية واتركيها تجف عند RT لمدة 24 ساعة قبل التخزين.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: القوارير غير الموصولة والمعبأة والملفوفة مستقرة لمدة 15 يوما تقريبا عند 4 درجات مئوية.

< p class = "jove_title" >2. ذبابة الفاكهة EDC الجرعات

1. قم بإعداد محلول مخزون مناسب لإذابة EDC المحدد في المذيب المناسب. بالنسبة إلى EE2 (الوزن الجزيئي 296.403) ، قم بإذابة 1.48 جم في 10 مل من الإيثانول بنسبة 100٪ لصنع محلول مخزون 0.5 متر وتخزينه عند -80 درجة مئوية
   أنذر: تعتبر EDCs ملوثة بيئية ويجب اتخاذ الاحتياطات اللازمة للتعامل معها.
قم
2. بتخفيف محلول مخزون EE2 في 10٪ إيثانول في الماء (حجم / حجم) من أجل الحصول على محلول 100 ملليمتر. قم بعمل التخفيفات التالية (0.1 ملي مولار و 0.5 ملي مولار و 1 ملم) في طعام CM ، بدءا من أقل تركيز واستخدام نفس التركيز النهائي للمذيب لكل مجموعة علاجية. لقوارير التحكم ، استخدم نفس حجم المذيب وحده.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يوصى بالحفاظ على التركيز النهائي للمذيب منخفضا قدر الإمكان ، مع الأخذ في الاعتبار أن التركيز النهائي للإيثانول يجب ألا يتجاوز 2٪ في طعام الذباب.
3. أضف المحلول الذي يحتوي على التخفيف الصحيح ل EDC المحدد إلى الطعام القائم على دقيق الذرة قبل التصلب ، واخلطه جيدا باستخدام محضر الطعام ، وقم بتوزيع 10 مل في قوارير ، وقم بتغطيته بشاش قطني واتركه يجف عند RT لمدة 16 ساعة قبل الاستخدام.
   <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: استخدم هذه الوسيلة مباشرة بعد تحضيرها.
4. لتربية البالغين ، قم بإعداد محاليل EE2 مختلفة (10 ملي مولار و 50 ملي مولار و 100 ملي مولار على التوالي) في 10٪ إيثانول في الماء (حجم حجم / حجم) وطبقة 100 ميكرولتر من كل منها على سطح AM ، من أجل الحصول على التركيز المطلوب ل EE2 (0.1 ملي مولار ، 0.5 ملي مولار و 1 ملليمتر). للتحكم ، استخدم نفس حجم المذيب وحده.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بدلا من ذلك ، أضف المحلول الذي يحتوي على التخفيف الصحيح ل EDC المحدد إلى كمية صغيرة من AM في أنبوب مخروطي سعة 50 مل ، وقم بتدوير 1 مل منه إلى طبقات على سطح قوارير AM.
   1. قم بتغطية القوارير بشاش قطني ، واتركها تجف في RT لمدة 12-16 ساعة تحت تقليب لطيف واستخدمها على الفور.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يجب تعديل عملية التجفيف تجريبيا لأنها تعتمد على الرطوبة المحيطة.

< p class = "jove_title" >3. تربية الذباب

1. استخدم سلالة متساوية الجين قوية ، مثل Oregon R ، يتم الحفاظ عليها من قبل عدة أجيال في المختبر.
2. احتفظ بالذباب في حاضنة رطبة يتم التحكم في درجة حرارتها ، مع ضوء طبيعي لمدة 12 ساعة: 12 ساعة من الفترة الضوئية المظلمة عند 25 درجة مئوية في قوارير تحتوي على طعام CM.
3. في كل اختبار ، استخدم القوارير في RT.

4. بروتوكول Lifespan

1. قم بإعداد 20 قارورة من الذباب مع 8 إناث و 4 ذكور والمنزل عند 25 درجة مئوية في سم (10 مل لكل منهما).
2. بعد 4 أيام ، تخلص من الذباب وضع القوارير مرة أخرى في الحاضنة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن استخدام هذه الذباب للبدء من جديد للحصول على مجموعات أخرى متزامنة مع العمر من الذباب.
3. في وقت متأخر من بعد ظهر اليوم 9 ، قم بإزالة جميع الذباب المغلق حديثا من القوارير وأعد القوارير إلى الحاضنة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يبدأ عدد قليل من البالغين في الإغلاق في وقت مبكر من اليوم التاسع. يسمح التخلص من هذه الذباب بجمع أكبر عدد ممكن من الذباب المتزامن ، وتجنب الاختيار غير المبالي للظهور المبكر.
4. بعد 16-24 ساعة ، قم بنقل الذباب البالغ (1 يوم العمر) من كلا الجنسين إلى أربع مجموعات من زجاجات سعة 250 مل تحتوي على طعام AM مكمل بثلاثة تركيزات مختلفة من EDC وواحدة مع المذيب وحده. إذا لزم الأمر ، اجمع دفعة أخرى في اليوم التالي.
5. حافظ على الذباب عند 25 درجة مئوية لمدة 2-3 أيام للسماح له بالتزاوج.
   < الطبقة القوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يتوافق يوم النقل إلى قوارير الطعام AM مع اليوم الأول من مرحلة البلوغ.
6. بعد يومين أو ثلاثة أيام ، قم بفرز كل مجموعة من الذباب حسب الجنس إلى مجموعتين تحت التخدير الخفيف ثاني أكسيد الكربون₂. قسم كل جنس بشكل عشوائي إلى خمس قوارير لكل علاج بكثافة 20 فردا لكل قارورة ، حتى يكون هناك ثلاثة مكررات من 5 قوارير متوازية لكل جنس لكل علاج><. <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: اعمل مع مجموعات صغيرة من الذباب من أجل منع المشكلات الصحية المحتملة طويلة الأمد بسبب وقت التعرض الطويل لثاني أكسيد الكربون₂.
7. قم بإعداد جدول بيانات العمر الافتراضي الذي يتم فيه طرح عدد الذباب الميت من عدد الذباب الباقي على قيد الحياة إلى النقل السابق ، بحيث يتم الحصول تلقائيا على عدد الناجين في كل نقل.
8. انقل الذباب إلى قوارير جديدة تحتوي على الطعام المقابل كل 3 أيام في نفس الوقت وتحقق من الوفاة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يتم النقل بدون تخدير يمكن أن يكون له تأثير سلبي طويل المدى على طول عمر الذبابة.
   1. في كل عملية نقل ، سجل عمر الذباب وعدد الذباب الميت.
      < الفئة القوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يتم حساب عدد الذباب الباقي تلقائيا في جدول البيانات ولكن يوصى بالتحقق منه بصريا. لا ينبغي النظر في الذباب الذي يهرب أو يموت عن طريق الخطأ أثناء النقل. احرص على عدم عد الذباب الميت مرتين الذي تم نقله إلى القارورة الجديدة للإبلاغ عن هذه الملاحظة في جدول البيانات.
   2. كرر الخطوتين 4.8 و 4.8.1 حتى يموت كل الذباب.
9. لكل مجموعة علاجية ، قم بإنشاء منحنى البقاء على قيد الحياة كما هو موضح في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1 ، من أجل عرض احتمالية بقاء الذبابة على قيد الحياة في أي وقت معين.
10. قم بإجراء ثلاث تجارب مستقلة لكل مجموعة معالجة من الذباب ، باستخدام 100 ذبابة مغلقة حديثا لكل تجربة.
11. إعداد جدول للإبلاغ عن متوسط العمر (متوسط أيام البقاء على قيد الحياة لجميع الذباب لكل مجموعة) ونصف وقت الوفاة (الفترة الزمنية بالأيام المطلوبة للوصول إلى 50٪ من الوفيات) والحد الأقصى للعمر (الحد الأقصى لعدد الأيام اللازمة للوصول إلى 90٪ من الوفيات).
12. احسب الفروق في النسبة المئوية بين كل مجموعة علاجية فيما يتعلق بالمجموعة الضابطة.
13. إجراء التحليل الإحصائي لمقارنة مجموعات العلاج المختلفة.

النتائج

الشكل 1: منحنيات العمر. على اليسار ، تم الإبلاغ عن جدول تمثيلي تم فيه تسجيل عدد الذباب الميت كل 3 أيام ، سواء لمجموعة العلاج (متوسط + EDC [0.05 ملي مولار EE2]) أو للمجموعة الضابطة (متوسط + مذيب) ، طوال الفترة التجريبية بأكملها. تم حساب متوسط العمر الافتراضي لكل مجموعة باستخدام مجموع المصفوفة. المنتج؛ قامت المجموعة المعالجة بتقصير متوسط العمر مقارنة بالمجموعة الضابطة. على اليمين ، يظهر منحنى بقاء نموذجي لذ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 17α-Ethinylestradiol سيغما E4876-1G أجار لذبابة الفاكهة المتوسطة بيوسيجما 789148 دقيق الذرة كاليفورنيا بيانكا ذبابة الفاكهة قوارير بيوسيجما 789008 25 مم × 95 مم ذبابة الفاكهة قوارير بيوسيجما 789009 29 مم × 95 مم ذبابة الفاكهة قوارير كالتيك 187 22 مم × 63 مم ايثانول فلوكا 2860 زجاجه زجاجات 250 مل قوارير زجاجية تكنولوجيا الميكروتقنية شارع 10024 أنبوب مسطح القاع 100 × 24 خميرة النجاح الفوري إسكا خميرة بودرة ميثيل 4-هيدروكسي بنزوات سيغما H5501 مجهر مجسمة مع مصابيح LED لايكا S4E سكروز هيميديا ميغابايت025 خلاط يدوي بيمي أريتي محضر طعام