الإصابة العصبية الناجمة عن الليزر ثنائي الفوتون: طريقة لمراقبة تنكس المحور العصبي وتجديده في يرقات ذبابة الفاكهة

الملخص

المصدر: Li ، D. ، et al. ذبابة الفاكهة في الجسم الحي نموذج إصابة لدراسة التجديد العصبي في الجهاز العصبي المحيطي والمركزي. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو الاستئصال بالليزر ثنائي الفوتون للمحاور العصبية في يرقة ذبابة الفاكهة السوداء ومثال على بروتوكول للحث على الإصابة وتصوير موقع الإصابة.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Li et al. ، ذبابة الفاكهة في نموذج إصابة الجسم الحي لدراسة التجديد العصبي في الجهاز العصبي المحيطي والمركزي ، J. Vis. Exp. (2018).

فئة

1. إصابة الفوتون والتصوير متحد البؤر

1. إعداد المجهر
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تم استخدام مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر مع ليزر ثنائي الفوتون لهذه التجربة ، ولكن الأنظمة الأخرى ذات الإعداد المكافئ ستكون كافية أيضا. تم استخدام ليزر الفوتون ثنائي الفوتون (930 نانومتر) لإيصال الإصابة وتم استخدام ليزر الأرجون (488 نانومتر) للتصوير متحد البؤر ل GFP.
   1. في بداية كل جلسة ، قم بتشغيل الليزر ثنائي الفوتون و / أو الليزر (الليزر) متحد البؤر ، والمجهر. افتح برنامج التصوير.
   2. بالنسبة لإصابة الفوتونين ، قم بإعداد المعلمات التالية لتصوير GFP باستخدام ليزر ثنائي الفوتون عند 930 نانومتر (1،950 ميجاوات).
      1. حدد وضع مسح الخط. افتح الثقب على طول الطريق. زيادة شدة الليزر إلى ~ 20٪ (390 ميجاوات).
      2. حدد 512 × 512 كمسح ضوئي للإطار. استخدم سرعة المسح الضوئي القصوى (عادة مع وقت بقاء البكسل عند 0.77 ميكرو ثانية). تأكد من أن متوسط الرقم هو 1 وعمق البت 8 بت.
      3. اضبط الكسب على ~ 750 ، والإزاحة على 0.
      4. احفظ هذا البروتوكول التجريبي المحدد مسبقا ك 2P GFP 930 Ablaation ، مما يسمح بإعادة الاستخدام بسهولة في التجارب المستقبلية.
   3. للتصوير متحد البؤر ، قم بإعداد المعلمات التالية لتصوير GFP باستخدام ليزر الأرجون عند 488 نانومتر:
      1. حدد علامة التبويب اكتساب ثم Z-stack.
      2. ضمن "الليزر" ، قم بتشغيل طاقة ليزر الأرجون 488 نانومتر.
      3. انتقل إلى القنوات ، وحدد الليزر 488 مم ، وقم بزيادة طاقة الليزر إلى 5-10٪. بالنسبة للثقب ، استخدم وحدة التهوية 1-2 (AU). اضبط الكسب على 650.
      4. في وضع الاكتساب ، حدد 1024 × 1024 كمسح ضوئي للإطارات ، واستخدم سرعة المسح القصوى ، ومتوسط عدد 2 ، وعمق بت 8 بت.
      5. احفظ هذا البروتوكول التجريبي المحدد مسبقا بتنسيق GFP Imaging.
2. تخدير اليرقات مع ثنائي إيثيل الأثير والتركيب
   1. في غطاء الدخان ، ضع طبقا زجاجيا مقاس 60 مم في طبق بتري بلاستيكي مقاس 15 سم. قم بطي قطعة من المناديل الورقية وضعها في قاع الطبق الزجاجي ، ثم ضع طبق أجار عصير العنب على المنديل. أضف ثنائي إيثيل الأثير إلى الطبق الزجاجي ، إلى النقطة التي يتم فيها نقع المناديل الورقية وتبقى طبقة من الأثير السائل في الطبق. احتفظ بالغطاء في جميع الأوقات.
   2. قم بإعداد شريحة زجاجية مع قطرة واحدة من زيت الهالوكربون 27 في المنتصف. أضف 4 بقع من الشحوم المفرغة على الزوايا الأربع للشريحة ، لدعم الغطاء لاحقا.
   3. استخدم الملقط لالتقاط يرقة نظيفة ووضعها على طبق أجار في طبق زجاجي مقاس 60 مم. غطي الطبق الزجاجي بغطاءه وانتظري حتى تتوقف اليرقة عن الحركة. بالنسبة لإصابة / تصوير PNS ، أخرج اليرقة بمجرد توقف ذيلها عن الارتعاش. بالنسبة للجهاز العصبي المركزي ، انتظر حتى تصبح اليرقة بأكملها بلا حراك ، وخاصة أجزاء الرأس.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: توقيت التعرض للأثير أمر بالغ الأهمية. انظر المناقشة.
   4. التقط اليرقة المخدرة بعناية وضعها في وضع مستقيم في قطرة زيت الهالوكربون على الشريحة. أضف غطاء أعلى الشريحة. استخدم ضغطا برفقا للضغط على الغطاء لأسفل ، حتى تلامس اليرقة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
   5. اضبط موضع اليرقة عن طريق دفع الغطاء برفق نحو اليسار أو اليمين لدحرجة اليرقة ، بحيث يكون الخلية العصبية / المحور العصبي / التغصنات محل الاهتمام في الأعلى والأقرب إلى عدسة المجهر.
   6. بالنسبة لإصابة الجهاز العصبي المحيطي ، قم بتركيب الجانب الظهري لليرقة لأعلى ، بحيث تكون كلتا القصبة الهوائية مرئية. ثم قم بلف اليرقة ~ 30 درجة إلى اليسار لإصابة محاور الخلايا العصبية من الفئة الثالثة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب و 1 ج) ، 90 درجة لإصابة محاور الخلايا العصبية من الفئة الرابعة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب و 1 ه) ، أو ~ 30 درجة لإصابة التشعبات العصبية من الفئة الرابعة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ).
   7. بالنسبة لإصابة الجهاز العصبي المركزي ، ضع اليرقة لتكون الجانب البطني تماما لأعلى (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 3أ) ، بحيث تكون منطقة الاهتمام أقرب إلى عدسة المجهر في المستوى z.
3. الإصابة بالليزر ثنائي الفوتون
   1. ضع الشريحة مع اليرقة تحت المجهر وثبتها في مكانها مع حامل الشريحة على المسرح. استخدم هدف 10X (0.3 NA) للعثور على اليرقة.
   2. أضف قطرة واحدة من الزيت الموضوعي إلى الغطاء ، وقم بالتبديل إلى هدف 40X (1.3 NA) واضبط التركيز البؤري.
   3. قم بالتبديل إلى وضع المسح وأعد استخدام البروتوكول التجريبي 2P GFP 930 Ablaation. تأكد من فتح الثقب بالكامل.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب تحسين التكوين بناء على الأنظمة الفردية.
   4. ابدأ الوضع المباشر لتحديد منطقة الاهتمام (ROI) ، وقم بضبط الإعدادات لتحقيق جودة صورة جيدة باستخدام التكبير/التصغير المناسب.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الغرض من هذه الخطوة هو العثور على الخلايا العصبية / المحور العصبي / التغصنات لإصابتها ، بدلا من التقاط صورة بأفضل جودة. لذلك ، استخدم الحد الأدنى من الإعدادات الكافية لتصور المنطقة المستهدفة ، لتجنب التعرض المفرط أو التبييض الضوئي.
   5. إيقاف الفحص المباشر، بحيث يصبح الزر Crop متاحا. دع الصورة الثابتة تعمل كخارطة طريق. حدد وظيفة الاقتصاص واضبط نافذة المسح للتركيز على الهدف المراد إصابته.
   6. تقليل عائد الاستثمار ليكون حجم موقع الإصابة المحتمل. على سبيل المثال ، ما عليك سوى تغطية عرض المحور العصبي أو التغصنات ، لضمان دقة الإصابة وتقليل الضرر الذي يلحق بالأنسجة المجاورة. إذا رغبت في ذلك ، قم بتكبير عائد الاستثمار قبل الاقتصاص ، مما يسمح بإصابة أكثر دقة.
   7. افتح نافذة تصوير جديدة. تقليل سرعة المسح وزيادة شدة الليزر. حدد الزيادة في شدة الليزر بناء على إشارة مضان الأنسجة الممسوحة ضوئيا في الوضع المباشر.
   8. عادة ، اضبط شدة الليزر ثنائي الفوتون بدءا من 25٪ لإصابة PNS و 50-100٪ لإصابة VNC. بالنسبة لإصابة المحور العصبي PNS ، تأكد من أن شدة الليزر ~ 480 ميجاوات وأن وقت سكون البكسل هو 8.19 ميكرو ثانية. بالنسبة لإصابة المحور العصبي VNC ، تأكد من أن شدة الليزر ووقت سكون البكسل عادة ما تكون 965-1930 ميجاوات و 8.19-32.77 ميكرو ثانية ، على التوالي.
   9. ابدأ المسح المستمر. اترك المؤشر يحوم فوق الزر Continuous (المسح المستمر). راقب الصورة عن كثب وأوقف الفحص بمجرد ملاحظة زيادة كبيرة في التألق.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يرجع ظهور ارتفاع التألق إلى التألق الذاتي في موقع الإصابة.
   10. قم بالتبديل مرة أخرى إلى الوضع المباشر عن طريق إعادة استخدام الإعدادات. ابحث عن منطقة الاهتمام التي تم استهدافها للتو عن طريق ضبط التركيز.
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: من المؤشرات الجيدة على الإصابة الناجحة ظهور فوهة بركان صغيرة أو هيكل يشبه الحلقة أو حطام موضعي في موقع الإصابة.
   11. انتقل إلى الخلية العصبية التالية وكرر من الخطوة 1.3.5 ، لإصابة خلايا عصبية متعددة في واحد. أو كرر الخطوة 1.3.5 مع زيادة الطاقة تدريجيا و / أو تقليل سرعة المسح إذا كانت الإصابة الأولية غير كافية.
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: في حالة ارتفاع طاقة الليزر ، ستظهر منطقة كبيرة تالفة في صورة المسح المباشر بعد الإصابة. قد تتسبب الإصابات الزائدة في موت اليرقة.
   12. استرجع اليرقة عن طريق إزالة الغطاء بعناية ونقل اليرقة المصابة إلى طبق جديد مع عجينة الخميرة. تخلص من عدة كهوف على صفيحة أجار بالملقط. بدلا من ذلك ، اصنع جزيرة أجار في اللوحة بدلا من استخدام اللوحة بأكملها ، لتقليل احتمالية زحف اليرقة خارج اللوحة.
   13. ضع الطبق في طبق بتري مقاس 60 مم بمنديل مبلل (مبلل بمحلول حمض البروبيونيك بنسبة 0.5٪) وزرعه في درجة حرارة الغرفة أو 25 درجة مئوية < br / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستبقى اليرقة في مرحلة اليرقات لمدة يوم إضافي تقريبا في درجة حرارة الغرفة (22 درجة مئوية) مقارنة ب 25 درجة مئوية.
4. التصوير متحد البؤر بعد الإصابة
   1. قم بتصوير اليرقة المصابة في النقاط الزمنية المرغوبة عن طريق تحضير اليرقة باستخدام نفس إجراء التخدير والتركيب كما في الخطوة 1.2 ، ثم التصوير بالليزر متحد البؤر.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قم بتصوير اليرقة بعد 24 ساعة من الإصابة (الذكاء الاصطناعي) لتأكيد الإصابة المحورية وعند 48 ساعة الذكاء الاصطناعي (الخلايا العصبية من الفئة الرابعة) أو 72 ساعة من الذكاء الاصطناعي (الخلايا العصبية من الفئة الثالثة da) لتقييم التجديد.
   2. حدد موقع اليرقة باستخدام هدف 10X ، ثم قم بالتبديل إلى هدف 25X (0.8 NA). أعد استخدام البروتوكول التجريبي GFP Imaging.
   3. انقر فوق الزر Live وابحث عن نفس الخلايا العصبية المصابة سابقا.
   4. قم بتعيين مواضع Z الأولى والأخيرة في نافذة الفحص المباشر. اضغط على إيقاف وانقر فوق بدء التجربة للحصول على صورة Z-stack.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تأكد من تضمين نقطة التطبيع (نقطة تقارب المحور العصبي) عند التقاط الصور بحيث يكون القياس الكمي للتجديد ممكنا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1D ، 1F) - تمت مناقشة ذلك بمزيد من التفصيل في قسم تحليل البيانات.
   5. قم بالتبديل إلى معالجة الصور ، وحدد الصورة التي تم التقاطها للتو ، وقم بإنشاء إسقاط أقصى كثافة. احفظ كل من صور العرض z-stack والصور ذات الكثافة القصوى.

النتائج

الشكل 1: يعرض تجديد محور عصبي Da في المحيط خصوصية الفئة. (أ و ب) رسم تخطيطي يوضح موضع اليرقات. (ج) الرسم التخطيطي للخلايا العصبية من الفئة الثالثة دا. (د) محاور من الفئة الثالثة da الخلايا العصبية ddaF ، المسماة ب 19-12-Gal4 ، UAS-CD4-tdGFP ، repo-Gal80 / + ، تفشل في إعادة النمو. (ه) رسم تخطيطي للفئة الرابعة دا الخلايا العصبية. (F) محاور ...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ثنائي إيثيل الأثير ، كاشف ACS ، لا مائي أكروس أورجانكس AC615080010 زيت هالوكربون 27 جينيسي العلمية 59-133 حمض البروبيونيك جي تي بيكر طراز U33007 غطاء النظارات: مستطيلات فيشر ساينتيك 12-544-د 50 مم × 22 مم مجهر المسح الضوئي بالليزر Zeiss LSM 880 زييس برنامج Zen زييس الحرباء الترا II متماسك