الحقن المجهري لذبابة الفاكهة الخلايا الممرضة: طريقة للتوصيل داخل الخلايا

الملخص

المصدر: Catrina، I. E.، et al. تصور وتتبع mRNAs الذاتية في غرف بيض ذبابة الفاكهة السوداء الحية. J. Vis. Exp. (2019).

نظرا لحجمها الكبير وتنظيمها البسيط نسبيا ، فإن خلايا ممرضة ذبابة الفاكهة مناسبة بشكل مثالي لدراسات تصوير الخلايا الحية. يصف هذا الفيديو طريقة الحقن المجهري لتوصيل المركبات الخارجية إلى الخلايا ، ويوضح البروتوكول المميز الإجراء باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية التي تسمى المنارات الجزيئية (MBs) المستخدمة لتصور نصوص mRNA الذاتية.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتبس من Catrina et al. ، تصور وتتبع mRNAs الذاتية في ذبابة الفاكهة الحية Egg Chambers، J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_title" >1. تصميم ميغابايت لتصوير الخلايا الحية

1. قم بطي تسلسل الحمض النووي الريبي المستهدف للتنبؤ بالهيكل الثانوي لهدف mRNA باستخدام "نموذج الحمض النووي الريبي" من خادم mfold (http://unafold.rna.albany.edu/?q=mfold/RNA-Folding-Form).
   1. قم بلصق / تحميل التسلسل المستهدف بتنسيق FASTA ، وحدد 5 أو 10٪ دون المستوى الأمثل (الهياكل ذات الطاقة الحرة للطي في حدود 5 أو 10٪ من قيمة MFE ، على التوالي) ، واضبط الحد الأقصى لعدد الطيات المحسوبة وفقا لذلك (على سبيل المثال ، أكبر بنسبة 10٪ دون المستوى الأمثل).
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يسمح تضمين الهياكل الثانوية دون المستوى الأمثل عند تصميم MBs بتحديد المناطق داخل mRNA المستهدف والتي قد تكون أكثر مرونة أو أكثر صلابة مما هو متوقع لبنية الحد الأدنى من الطاقة الحرة (MFE) وحدها ، مما يحسن التصميم العام ل MBs المناسبة لتصوير الخلايا الحية.
   2. حدد "وظيفة فورية" لأهداف mRNA المكونة من 800 نيوكليوتيد (nt) ، أو "وظيفة دفعية" لأطوال mRNA بين 801 و 8,000 nt. احفظ ملف "ss-count" كملف نصي بسيط.
2. استخدم ملف "ss-count" الذي تم الحصول عليه في الخطوة 1.1 كمدخل لبرنامج PinMol (https://bratulab.wordpress.com/software/) مع المعلمات المطلوبة ، لتصميم عدة ميغابايت لهدف mRNA (انظر البرامج التعليمية التي تصف استخدام برنامج PinMol في https://bratulab.wordpress.com/tutorial-pinmol-mac/ ).
   1. تحديد خصوصية MBs المختارة عن طريق إجراء تحليل BLAST: استخدم "blastn" مع قاعدة البيانات المناسبة (على سبيل المثال بالنسبة إلى MBs الخاصة ب oskar mRNA ، استخدم قاعدة بيانات "refseq-rna" وكائن ذبابة الفاكهة السوداء).
   2. تحديد أي تعبير خاص بالأنسجة لهدف mRNA (على سبيل المثال ل oskar mRNA Flybase > أو بيانات التعبير عالية الإنتاجية > أو FlyAtlas Anatomy Microarray أو modENCODE Anatomy RNA-Seq ؛ http://flybase.org/reports/FBgn0003015) وقارن مع أي ضربات انفجار إيجابية. تخلص من المجسات التي تظهر >50٪ من التماثل المتقاطع مع mRNAs الأخرى التي يتم التعبير عنها أيضا في الأنسجة / الخلية ذات الأهمية.
3. حدد زوج الفلوروفور والمروي المناسب لإعداد الفحص المجهري المتاح لإجراء تصوير الخلايا الحية (مثل Cy5 / BHQ2).

< p class = "jove_title" >2. MB التوليف والتنقية والتوصيف

1. استخدم التوليف والتنقية الداخلية كما هو موضح سابقا في Bratu ، طرق في البيولوجيا الجزيئية (2006) ، أو خدمات من مقدمي الخدمات التجاريين ، لتصنيع وتنقية واحد إلى خمسة ميجابايت (انظر الملاحظة أعلاه) ، باستخدام مخطط الملصقات التالي: [5'(Fluorophore) - (رابط C3 أو C6) - (تسلسل 2'-O-methyl MB) - (Quencher) 3 ']. تنقية الميغابايت باستخدام HPLC في الطور العكسي ، في المنزل أو باستخدام خدمات المزود التجاري.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن تحتوي الفوسفوراميديت المستخدمة في تخليق المسبار الآلي على تعديل 2'-O-methyl ribonucleotide. يمكن للمرء أيضا استخدام الوهم المتناوب بين الحمض النووي المقفل (LNA) وتعديلات 2'-O-methyl لزيادة استقرار الهجين بين MB أقصر و mRNA المستهدف.
2. قم بتصنيع قليل النوكليوتيدات من الحمض النووي الذي يتطابق مع تسلسل منطقة الحمض النووي الريبي المستهدفة وبالتالي فهي مكملة لمنطقة مسبار MBs ، لاستخدامها في التوصيف في المختبر (انظر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 ؛ الملاحظة أعلاه). تعظيم تهجين MB مع تقليد هدف الحمض النووي قليل النوكليوتيدات ، من خلال تضمين أربعة نيوكليوتيدات إضافية في كل طرف من طرفي الحمض النووي المستهدف ، كما هو موجود في تسلسل mRNA المستهدف.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن إجراء توصيف أكثر صرامة لكفاءة MB للكشف عن التسلسل المستهدف باستخدام أهداف الحمض النووي الريبي المركبة في المختبر بدلا من قليل النوكليوتيدات الحمض النووي التكميلية.
3. قم بإجراء التمسخ الحراري للمغنيد الميغابايت وحده ، وقياس درجة حرارة انصهاره (Tm) ، وتأكد من أن MB يفترض شكل دبوس الشعر المطلوب عند درجة الحرارة الفسيولوجية. لقد لاحظنا قيم Tm بين 60 و 90 درجة مئوية.
4. قم بإجراء التمسخ الحراري للمغنيد الميغابايت في وجود هدف قليل النوكليوتيد للحمض النووي وقياس MB: TM الهجين المستهدف MB: DNA ، كما هو موضح سابقا في Bratu ، طرق في البيولوجيا الجزيئية (2006). مطلوب [تم] بين 55 و 60 درجة مئوية ل MB: [دنا] هجينة.
5. قم بإجراء تفاعلات التهجين في المختبر مع هدف قليل النوكليوتيد المقابل للحمض النووي ، وتحديد كفاءة تكوين MB: DNA الهجين عند درجة الحرارة الفسيولوجية ، كما هو موضح سابقا في Bratu ، طرق في البيولوجيا الجزيئية (2006). حركية التهجين السريع مع تقليد هدف الحمض النووي مطلوبة ، ولكن MBs التي لا تظهر كفاءة تهجين عالية مع أهداف الحمض النووي قد يكون لها أداء أفضل مع mRNA المستهدف في المختبر و / أو في الجسم الحي.

< p class = "jove_title" >3. تشريح وتحضير غرف البويضات الفردية للحقن المجهري

1. قم بإطعام الإناث المتزاوجة حديثا لمدة 2-3 أيام بمعجون الخميرة الطازج.
2. ذباب التخدير على وسادة ثاني أكسيد الكربون₂ ، وباستخدام ملاقط دقيقة (Dumont # 5) ، انقل 1-2 أنثى إلى قطرة من زيت الهالوكربون 700 على زلة غطاء زجاجي.
3. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتوجيه الذبابة مع الجانب الظهري لأعلى تحت مجهر مجسم. قم بتشريح بطن الأنثى عن طريق عمل شق صغير في الطرف الخلفي واضغط برفق على زوج المبايض في الزيت.
4. قم بزرع المبايض على قطرة زيت على غطاء جديد. أمسك أحد المبيضين برفق باستخدام ملاقط واحدة أثناء الضغط على أصغر مراحل المبيض باستخدام الملقط الآخر. يتم توطين oskar mRNA بنشاط في منتصف تكوين البويضات وبعدها (المراحل > 7) ، ويصعب حقن غرف البيض الأصغر (المراحل < 7) ولا تعيش لفترة طويلة. اسحب ببطء على زلة الغطاء (بحركة لأسفل) حتى يتم عزل المبيض الفردي أو غرف البيض ومحاذاة عموديا. قم بفصل غرف البيضة المفردة عن طريق إزاحة المراحل غير المرغوب فيها من سلسلة بيض المبيض.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تأكد من أن غرف البيض التي يتم مضايقتها بشكل فردي لا تطفو في الزيت ، وأنها تلتصق بقلة الغطاء. هذا مهم لكل من الحقن المجهري الناجح والحصول على الصور.

< p class = "jove_title" >4. الحقن المجهري ل MBs في خلايا الممرضة في غرف البويضات

1. قم بإعداد محلول MB ، باستخدام منارة جزيئية واحدة (على سبيل المثال osk2216Cy5) ، أو مزيج من اثنين من MBs التي تستهدف mRNAs مختلفة والتي تم تصنيفها بالفلوروفورات المتميزة طيفيا (على سبيل المثال osk2216Cy5 و drongo1111Cy3). استخدم تركيزا 200-300 نانوغرام / ميكرولتر لكل ميجابايت في HybBuffer (50 ملي مولار Tris-HCl - درجة الحموضة 7.5 ، 1.5 ملي مللي كلوريد₂ و 100 ملي كلوريد الصوديوم). لمزيج من أربعة ميغابايت مصنفة بنفس الفلوروفور التي تستهدف نفس الرنا المرسال عند 200 نانوغرام / ميكرولتر لكل منها في HybBuffer (على سبيل المثال osk82 ، osk1236 ، osk2216). قم بتدوير محلول MB مباشرة قبل تحميل الإبرة للحقن المجهري.
2. حدد الهدف. يوصى باستخدام هدف زيت 40x للعثور على غرفة بيض مناسبة ولإجراء الحقن المجهري.
3. قم بتركيب الغطاء مع حجرة البيض المقطعة على مرحلة المجهر. اطرح الهدف في موضع التركيز وحدد غرفة البويضة في مرحلة النمو المتوسطة إلى المتأخرة ، والتي يتم توجيهها بشكل صحيح للحقن المجهري (على سبيل المثال ، مع محور AàP عموديا على طرف الإبرة للسماح بالحقن السهل داخل خلية الممرضة القريبة من البويضة).
4. قم بتحميل إبرة (تجارية أو معدة في المنزل) بمحلول ~ 1 ميكرولتر ميجابايت (انظر الخطوة 1.1) وقم بتوصيلها بالحاقن الدقيق. للحقن المجهري في D. melanogaster غرف البيض ، قم بتوجيه الإبرة (انظر جدول المواد) بزاوية <45 درجة إلى مرحلة المجهر (على سبيل المثال 30 درجة) لتجنب ثقب العديد من خلايا الممرضة.
5. قم بإعداد الحاقن بضغط حقن 500-1,000 هكتوباسكال وضغط تعويض 100-250 هكتوباسكال (انظر جدول المواد).
6. حرك المسرح ببطء لإحضار منطقة من قطرة الزيت خالية من غرف
البيض.
7. باستخدام عصا التحكم الدقيقة ، اخفض الإبرة برفق في قطرة الزيت واجعل طرفها في التركيز باتجاه محيط مجال الرؤية.
8. قم بأداء وظيفة "نظيفة" لإزالة الهواء من طرف الإبرة والتأكد من وجود تدفق من الإبرة.
9. أحضر الإبرة إلى وضع المنزل وركز على حجرة البويضة المراد حقنها بشكل دقيق ، ثم أعد التركيز على الإبرة وضعها بالقرب من حافة حجرة البيضة.
10. قم بإجراء تعديل دقيق لموضع Z للهدف بحيث يكون الغشاء الذي يفصل خلايا البصيلات عن خلايا الممرضة في بؤرة التركيز.
11. أدخل الإبرة في خلية ممرضة وقم بالحقن لمدة 2-5 ثوان.
12. قم بإزالة الإبرة برفق وسحبها إلى وضع المنزل.
13. قم بتغيير الهدف إلى التكبير المطلوب للحصول على الصورة (60-63x أو 100x) ، وركز على غرفة البيض ، وابدأ في الاستحواذ.

المواد