$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول هو مقتطف من Du et al. ، استراتيجية فعالة لتوليد أنظمة نسخ ثنائية خاصة بالأنسجة في ذبابة الفاكهة عن طريق تحرير الجينوم ، J. Vis. Exp. (2018).
< p class = "jove_title" >1. علم الوراثة والفحص للذبابة (الشكل 1 والشكل 2)
- عندما تتطور الأجنة المحقونة إلى بالغين ، اعبر كل ذبابة G0 إلى الذباب الموازن. حدد الموازن المناسب للكروموسوم الذي يحتوي على الأليل المستهدف.
- قم بتخدير نسل F1 من كل صليب G0 على وسادة ثاني أكسيد الكربون2 واختر بشكل عشوائي 10-20 ذكرا تحت مجهر مجسم. انقلها بشكل فردي إلى إناث الموازن كما هو موضح في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 2.
- عندما تفقس يرقات F2 ، اختر الأب الفردي F1 من كل صليب واستخرج gDNA باستخدام بروتوكول تحضير الحمض النووي الجيني للذبابة الواحدة:
- تحضير المخزن المؤقت لاستخراج gDNA: 10 ملي مولار Tris-Cl درجة الحموضة 8.2 ، 1 ملي مولار EDTA ، 25 ملي كلوريد الصوديوم ، يخزن في درجة حرارة الغرفة. تحضير محلول مرق 20 مجم / مل من البروتيناز K وتخزينه في الفريزر.
- ضع كل ذبابة في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل وقم بتسمية الأنبوب. يحفظ في الفريزر -80 درجة مئوية طوال الليل.
- إعداد حجم عمل جديد من مخزن استخلاص gDNA يحتوي على 200 ميكروغرام / مل تركيز نهائي من البروتيناز K.
ملاحظة: لا تستخدم مخزن مؤقت قديما لهذه الخطوة.
- اسحق كل ذبابة لمدة 10-15 ثانية بطرف ماصة يحتوي على 50 ميكرولتر من محلول السحق دون توزيع السائل. استغني عن المخزن المؤقت المتبقي في الأنبوب واخلطيهم جيدا. احتضان عند 37 درجة مئوية لمدة 20-30 دقيقة.
- ضع الأنابيب في كتلة حرارية 95 درجة مئوية لمدة 1-2 دقيقة لتعطيل البروتيناز K.
- تدور لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم. قم بتخزين المستحضر في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمزيد من تحليل PCR.
- استخدم نفس الطريقة لتحضير gDNA من ذبابة nos-Cas9 ، والتي تعمل كعنصر تحكم سلبي. قم بإجراء شاشات تستند إلى PCR من ثلاث خطوات لتحديد HDR الصحيح "النهائي" (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1 ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 3) باستخدام gDNA لكل ذكر F1 كقالب5. استخدم 1 ميكرولتر من إعداد الحمض النووي في نظام تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل التالي: 10 ميكرولتر من 2x PCR Master Mix مع صبغة ، 1 ميكرولتر من كل برايمر (10 ميكرومتر) ، 1 ميكرولتر من قالب الحمض النووي ، و 7 ميكرولتر من ddH2O.
- كما هو موضح في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 3أ ، قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال fwd1 و rev1 للتحقق من وجود الإدراج أو الاستبدال ؛ قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام بادئات fwd2 و rev2 للتحقق من الإدخال أو الاستبدال من منطقة 3 '؛ قم بإجراء تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام الاشعال M13F و rev3 للتحقق من HDR "النهائي" (الجدول 1C).
- حافظ على خطوط الطيران مع HDR المؤكد وقم بإنشاء مخزونات متوازنة من جيل F2. يطير Outcross to the Balancer مرة أخرى لإزالة أي طفرات غير مقصودة على الكروموسومات الأخرى.
