التجفيف الكيميائي: تحضير العينة البيولوجية للفحص المجهري الإلكتروني (SEM)

الملخص

المصدر: Koon، M. A.، et al. تحضير الكائنات بدائية النواة وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائي للتحليل المورفولوجي في المجهر الإلكتروني الماسح (SEM). J. Vis. Exp. (2019).

الفحص المجهري الإلكتروني (SEM) هو أداة قوية لتصوير - في المقام الأول - السمات السطحية للعينة البيولوجية. ومع ذلك ، يعد التحضير المناسب للعينة أمرا بالغ الأهمية للحصول على صور عالية الجودة. يركز هذا الفيديو على خطوات الجفاف والتجفيف لتحضير ذبابة الفاكهة البالغة السليمة ل SEM.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Koon et al. ، إعداد الكائنات بدائية النواة وحقيقية النواة باستخدام التجفيف الكيميائي للتحليل المورفولوجي في الفحص المجهري الإلكتروني الماسح (SEM) ، J. Vis. Exp.(2019).

< p class = "jove_title" >1. التحضير والتثبيت

1. تحضير ذبابة الفاكهة السوداء (ذبابة الفاكهة).
   1. تخدير الذباب البالغ باستخدام ثاني أكسيد الكربون بنسبة 100٪. ضع البالغين المخدرين (حوالي 10 إلى 30 ذبابة) في قارورة غطاء لولبي بلاستيكي صغير أو أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 مل.
   2. اغمر الذباب المخدر في 1 مل من المثبت (1.25٪ جلوتارالديهايد ، 0.1 M عازلة الفوسفات ، درجة الحموضة 7.2) لمدة ساعتين (أو بين عشية وضحاها) عند 4 درجات مئوية. إذا طفو الذباب على سطح المثبت ، أضف بضع قطرات من 2.5٪ بولي إيثيلين جلايكول ثلاثي أوكتيل الفينيل لإضعاف التوتر السطحي للمثبت مما يسمح بالغمر الكلي للأنسجة. قم بإزالة المثبت باستخدام ماصة زجاجية.

< ص الفئة = "jove_title" >2. الغسيل والجفاف

1. اغسل وجفف ذبابة الفاكهة السوداء (ذبابة الفاكهة).
   1. اغسل العينة الثابتة ثلاث مرات ب 1 مل من محلول الفوسفات 0.1 M درجة الحموضة 7.2 في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بإزالة كل غسلة بماصة زجاجية ، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
   2. قم بتجفيف العينة باستخدام سلسلة الإيثانول المتدرجة ، لمدة 10 دقائق بحجم 1 مل في أنبوب ميكروفوج. تركيزات الإيثانول هي: 25٪ ، 50٪ ، 75٪ ، 80٪ ، 95٪ ، 100٪. قم بإزالة الإيثانول بماصة زجاجية ، مع الحرص على عدم إزالة الذباب.
   3. احتفظ بالعينة في أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل مع ما يكفي من الإيثانول بنسبة 100٪ لتغطية العينة قبل التجفيف.

< p class = "jove_title" >3. التجفيف

1. إجراء التجفيف الكيميائي باستخدام hexamethyldisilazane (HMDS).
   1. استبدل محلول الإيثانول بنسبة 100٪ بمحلول 1: 2 من HMDS و 100٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة. استبدل محلول 1: 2 بمحلول 2: 1 من HMDS و 100٪ إيثانول لمدة 20 دقيقة. استبدل محلول 2: 1 ب HMDS بنسبة 100٪ لمدة 20 دقيقة. كرر مرة واحدة.
      ملاحظة: HMDS قابل للاشتعال وسم حاد (طريق جلدي). يجب التعامل مع HMDS في غطاء دخان كيميائي باستخدام معدات الحماية الشخصية المناسبة بما في ذلك القفازات ومعطف المختبر وحماية العين.
   2. انقل العينة في HMDS ، إذا كانت في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل ، إلى طبق وزن من الألومنيوم يمكن التخلص منه. بمجرد دخولك إلى طبق الوزن المصنوع من الألومنيوم ، استبدل HMDS بنسبة 100٪ بما يكفي من HMDS الطازج بنسبة 100٪ لتغطية العينة.
   3. انقل العينة إلى مجفف بلاستيكي أو زجاجي غير مفرغ من الهواء مع مجفف طازج (بعمق 5-6 سم) وضعه في غطاء دخان كيميائي. بدلا من ذلك ، ضع العينة مباشرة في غطاء دخان كيميائي حتى تجف بغطاء فضفاض ، مثل صندوق ، لمنع الحطام من السقوط على العينة. اترك العينة تجف لمدة 12 إلى 24 ساعة.

< p class = "jove_title" >4. تصاعد

1. جبل ذبابة الفاكهة السوداء (ذبابة الفاكهة).
   1. قم بتسمية الجزء السفلي من كعب التثبيت المصنوع من الألومنيوم للإشارة إلى ما يتم وضعه في الأعلى.
      ضع الذباب المجفف في الموضع المطلوب على علامة تبويب لاصقة أو لاصقة كربونية مثبتة في الجزء العلوي من كعب تحت مجهر تشريح باستخدام ملاقط دقيقة.
   2. ضع مادة لاصقة موصلة للفضة ، أي الطلاء الفضي ، حول الحواف الخارجية للبذرة. قم بتوصيل الطلاء الفضي بالذباب باستخدام عود أسنان لضمان التوصيل. لا تسمح للطلاء بلمس منطقة التصوير المطلوبة.
   3. ضع البذرة في صندوق حامل كعب الروتين وضع صندوق حامل كعب الروتين المفتوح في مجفف. اترك الطلاء الفضي يجف لمدة 3 ساعات على الأقل أو طوال الليل للحصول على أفضل النتائج.

المواد