حقن ذبابة الفاكهة البالغة: طريقة لتسليم المركب أو الملصق

الملخص

المصدر: Nazario-Toole ، A. E. ، Wu ، L. P. تقييم الاستجابة المناعية الخلوية لذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة السوداء ، باستخدام فحص البلعمة في الجسم الحي. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء حقن الذباب الحي البالغ ويتضمن مثالا على بروتوكول يتم فيه حقن الجسيمات المسماة والتريبان الأزرق في بطن الذبابة لفحص البلعمة.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Nazario-Toole and Wu ، تقييم الاستجابة المناعية الخلوية لذبابة الفاكهة ، ذبابة الفاكهة السوداء ، باستخدام فحص البلعمة في الجسم الحي ، J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_title" >1. تحضير جزيئات الفلورسين للحقن

1. إعادة تكوين 10 ملغ من جزيئات البكتيريا المقتولة بالحرارة المتوفرة تجاريا والمسومة بالفلورسين (انظر جدول المواد) إلى تركيز مخزون قدره 10 مجم / مل عن طريق إضافة 990 ميكرولتر معقم 1x PBS و 10 ميكرولتر 50 ملي مولار أزيد الصوديوم. دوامة للخلط.
   1. قسمها إلى حصوات 8 ميكرولتر تستخدم مرة واحدة في أنابيب 0.2 مل وتخزينها في صندوق مظلم عند 4 درجات مئوية لتقليل الحساسية المرتبطة بالضوء.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: مادة حافظة أزيد الصوديوم اختيارية ويمكن حذفها إذا تم تصنيع مخزون 10 مجم / مل من 1 مل معقم 1x PBS ، مقتبس ، وتخزينه عند -20 درجة مئوية.
2. اصنع محلولا سعة 10 مل من ألوان الطعام بنسبة 5٪ في 1x PBS عن طريق خلط 500 ميكرولتر من ملون الطعام الأخضر المصفى و9.5 مل معقم 1x PBS.
3. اغسل الجزيئات قبل الحقن لإزالة أزيد الصوديوم. امزج 42 ميكرولتر معقم 1x PBS و 8 ميكرولتر من 10 مجم / مل في أنبوب 1.7 مل. جهاز طرد مركزي بأقصى سرعة لمدة 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   1. قم بإزالة المادة الطافية ، وأضف 50 ميكرولتر 1x PBS ، وجهاز الطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 2.5 دقيقة في درجة حرارة الغرفة.
   2. كرر الخطوتين 1.3 و 1.3.1 2x ، ليصبح المجموع 3 غسلات.
   3. بعد الغسيل النهائي ، تخلص من المادة الطافية وأعد تعليق الجسيمات إلى 1.6 مجم / مل في 50 ميكرولتر من ألوان الطعام بنسبة 5٪ في 1x PBS.
   4. لف الأنبوب بورق الألمنيوم للحماية من الضوء. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية ، وتخلص منه بعد أسبوع واحد.

< p class = "jove_title" >2. تحضير محطة الحقن والذباب

1. جهز وسادة الحقن. لحقن ما يصل إلى 4 أنماط وراثية من الذباب في نفس الوقت ، استخدم شريط المختبر لتقسيم وسادة ذبابة مستطيلة CO₂ إلى 4 أقسام. على المقعد بالقرب من المجهر ، حدد مناطق لوضع القوارير بمجرد اصطفاف الذباب على الوسادة (واحدة لكل ركن من أركان الوسادة).
2. تحضير قوارير من الذباب المطابق للعمر ، 4-7 أيام ، للحقن. لكل سلالة سيتم اختبارها ، انقل 5 ذكور و 5 إناث إلى قارورة طازجة تحمل علامة من طعام الذباب المحضر واحتفظ بها عند 25 درجة مئوية.
3. قم بإعداد الحاقن الهوائي (انظر جدول المواد) عن طريق ضبط الجهاز على 100 مللي ثانية (رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز لطرد السائل - مما يسمح بتوصيل أحجام أقل من النانولتر) وضع TIMED.
4. تحضير شرائح المجهر. قم بقص شرائط بحجم 1.5 بوصة من الشريط الكهربائي ، وقم بطيها في حلقة مع الجانب اللاصق للخارج ، وضعها على شريحة مجهر موسمية.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الإبر الشعرية الزجاجية

1. اسحب الإبر الزجاجية (الشعيرات الدموية الزجاجية ذات الجدران الرقيقة) باستخدام مجتذب إبرة.
   1. أمسك الإبرة تحت المجهر بميكرومتر وكسر الطرف باستخدام ملاقط من الفولاذ المقاوم للصدأ # 5 نقطة دقيقة. أطراف 100 ميكرومتر كافية لاختراق بشرة الذبابة مع تقليل الجرح.
   2. قم بقياس حجم السائل الذي سيتم حقنه في كل ذبابة. قم بتحميل الإبرة بألوان طعام معقمة بنسبة 5٪ في 1x PBS وطرد السائل على قطرة من الزيت المعدني على ميكرومتر المرحلة 0.01 مم.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا كانت قطرة السائل كروية ، يتم حساب الحجم بالبيكوليتر على أنه (الحجم) ³/1910. ستخرج إبرة بقطر 100 ميكرومتر ~ 2 نانولتر في 100 مللي ثانية.

< p class = "jove_title" >4. حقن الذباب

1. ماصة 10 ميكرولتر من جزيئات 1.6 مجم / مل على مربع صغير من البارافيلم
   1. اسحب السائل إلى الإبرة وقم بتثبيته في فوهة الحاقن (انظر جدول المواد).
   2. قم بتخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ واصطفه في المنطقة المخصصة له على لوحة الطيران ، مع الجانب البطني لأعلى وتوجيه الرؤوس نحو مقدمة الوسادة. ضع القوارير في المناطق المقابلة على المقعد.
   3. حقن الذباب في الزاوية العلوية من البطن بمضخات 5 ، 100 مللي ثانية من السائل (~ 10 nL الإجمالي).
   4. انقل الذباب المحقون إلى القوارير المناسبة ، ولاحظ الوقت على القارورة. يحفظ عند 25 درجة مئوية.
2. قم بتحميل إبرة جديدة بمحلول تريبان الأزرق بنسبة 0.4٪.
3. اضبط الحاقن الهوائي على GATED، مما يسمح بتدفق مستمر للهواء لدفع السائل خارج الإبرة.
4. قم بتخدير الذباب بعد أن يستريح لمدة 30 دقيقة ويحقن بالتربان الأزرق حتى يمتلئ البطن ويتضخم.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: عند فحص نضوج البلعمة بجزيئات مصنفة بصبغة حساسة للأس الهيدروجيني ، اترك الذباب يرتاح لمدة 1 ساعة ولا تحقن باللون الأزرق قبل تركيب الذباب.
5. جبل الذباب على شرائح المجهر بشريط كهربائي ، الجانب البطني لأسفل. ادفع الأجنحة إلى جانب الذبابة وثبتها على الشريط. أيضا ، ادفع الرأس برفق في الشريط للتأكد من أن الذبابة لن تتحرك.

المواد

<جدول fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="دائما"> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td colspan = "1" > 5430-10 PicoNozzle Kit أجهزة الدقة العالمية < td colspan = "1" >5430-10 لماصة 1.0 مم بكتريا قولونية (سلالة K-12) الجسيمات الحيوية ، مترافق الفلورسين Invitrogen E2861 قتل الإشريكية القولونية المسمى ب FITC (الفلورسين). يستخدم لاختبار التعرف على الخلايا البلعمية وامتصاص البكتيريا سالبة الجرام. (~ 494 / ~ 518 نانومتر) مجتذب ماصة الإبرة David Kopf Instruments موديل 725 مضخة بيكو الهوائية PV820 أجهزة الدقة العالمية SYS-PV820 تستخدم مضخة PicoPump الهوائية PV820 للأدوات الدقيقة العالمية ضغوطا تفاضلية لاحتفاظ السائل في الإبرة الزجاجية بين الحقن.
يتحكم المستخدم يدويا في رشقات نارية قصيرة من ضغط الغاز لطرد السائل - مما يسمح بتوصيل كميات أقل من النانولتر.
تعتمد كمية السائل التي يتم تسليمها على متغيرين رئيسيين - حجم فتحة الإبرة الزجاجية ومقدار الوقت الذي يتم فيه تطبيق ضغط الحقن.
اضبط الأداة على وضع "TIMED" 100 مللي ثانية. الشعيرات الدموية الزجاجية رقيقة الجدار أجهزة الدقة العالمية < td colspan = "1" >TW100F-3 إبر للحقن. OD = 1.0 مم محلول تريبان الأزرق (0.4٪) سيجما < td colspan = "1" >T8154 يستخدم لإخماد التألق خارج الخلية للجسيمات المسماة بالفلورسين أو Alexa Fluor أو Texas Red.