$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول هو مقتطف من Bantel and Tessier ، مقايسة تفضيل الذوق لذبابة الفاكهة البالغة ، J. Vis. Exp. (2016).
< p class = "jove_title" >1. الجوع
- قم بإعداد قوارير تجويع الذباب عن طريق تشبع كرة قطنية بماء 18.2 MΩ في قاع قارورة ذبابة قياسية. بدلا من ذلك ، قم بتشبع شريط صغير من ورق الترشيح بماء 18.2 MΩ وضعه بزاوية داخل القارورة.
- اجمع الذباب في مجموعات من ~ 100 على وسادة ثاني أكسيد الكربون2 ثم أضف الذباب إلى قارورة معدة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يتم الحصول على أفضل النتائج مع التي يقل عمرها عن 5 أيام. ومع ذلك ، يمكن التحكم في العمر الدقيق للحيوانات كمتغير تجريبي لتحديد التغيرات في تفضيل الذوق بمرور الوقت.
- استخدم كرة قطنية أو سدادة رغوية لتأمين القوارير مغلقة. ضع القوارير على جانبها في حاضنة خاضعة للرقابة البيئية. حافظ على درجة الحرارة عند 25 درجة مئوية ، والرطوبة أعلى من 70٪. اترك القوارير دون أن تمس لمدة 24 ساعة.
2. فحص تفضيل الذوق
- قم بإعداد جميع المذقات للفحص في نفس يوم الاختبار.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستختلف المذقات الدقيقة التي سيتم استخدامها اعتمادا على السؤال التجريبي الذي يتم طرحه. فيما يلي أمثلة على المذاق المستخدمة في هذا البروتوكول. راجع القسم 4 للحصول على التحسينات.
- تحضير تاستانت التحكم (1 ملي مولار سكروز) عن طريق الجمع بين 10 ميكرولتر من محلول السكروز 100 ملي مولار ، و 13 ميكرولتر من تلوين الطعام الأحمر ، و 977 ميكرولتر من 18.2 ميجا أوم.
- قم بإعداد الطعم التجريبي (5 ملي مولار سكروز) عن طريق الجمع بين 50 ميكرولتر من محلول السكروز 100 ملي مولار ، و 10 ميكرولتر من تلوين الطعام الأزرق ، و 940 ميكرولتر من 18.2 ميجا أوم.
- قم بعمل غرف فحص باستخدام طبق بتري بلاستيكي قياسي مقاس 100 مم × 15 مم محضر بالطريقة التالية:
- ضع ثلاث قطرات من التحكم سعة 10 ميكرولتر بالقرب من حافة اللوحة عند موضع الساعة 12 و3 قطرات أخرى عند موضع الساعة 6. تأكد من أن التباعد بين القطرات متشابه.
- ضع ثلاث قطرات سعة 10 ميكرولتر من الأذن التجريبي بالقرب من حافة الصفيحة عند موضع الساعة 3 و3 قطرات أخرى عند موضع الساعة 9. تأكد من أن التباعد بين القطرات متشابه.
- كرر الخطوتين 2.2.1 و 2.2.2 لأكبر عدد ممكن من النسخ المتماثلة حسب الرغبة.
- أفرغ قارورة واحدة من ~ 100 ذباب جائع على وسادة ثاني أكسيد الكربون2 لفترة كافية لتخدير جميع (حوالي 10 ثوان). ادهن في منتصف حجرة الفحص المعدة وقم بتغطيتها بغطاء الطبق.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب تجنب فترات أطولمن التعرض لثاني أكسيد الكربون 2 لتحسين وقت التعافي والحد من التداخل مع سلوك التغذية. يمكن استخدام التعرض للثلج (~ 5 دقائق) للتخدير لتجنب التأثيرات السلوكية لثاني أكسيد الكربون2 التي قد تنشأ حتى عن التعرض المحدود.
- ضع غرفة الفحص في صندوق من الورق المقوى غير شفاف. تأكد من تسمية الجزء الخارجي من الصندوق بالحالة والنمط الجيني الذي يتم اختباره.
- ضع الإعداد بالكامل (غرفة الفحص الموجودة داخل صندوق من الورق المقوى من الخطوة 2.4) في حاضنة 25 درجة مئوية مع رطوبة لا تقل عن 70٪ لمدة ساعتين.
- كرر الخطوات من 2.3 إلى 2.5 لجميع النسخ المتماثلة.
- بعد ساعتين ، ضع غرف الفحص ، التي لا تزال موجودة داخل صناديق من الورق المقوى ، مباشرة في فريزر -20 درجة مئوية حتى تصبح جاهزة للقياس الكمي.
3. قياس قياس تفضيل الذوق
- اسمح لغرفة فحص واحدة بالتسخين إلى درجة حرارة الغرفة (حوالي 5 دقائق).
- تحت مجهر التشريح ، باستخدام فرشاة أو زوج من الملقط ، قم بتجميع بناء على لون بطنها: أحمر أو أزرق أو بنفسجي أو شفاف (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1).
- سجل عدد في كل مجموعة. ضع في اعتبارك أن الواضحة لم تشارك في الفحص وبالتالي لا تدرجها في أي حسابات.
- احسب مؤشر التفضيلات وفقا لإحدى المعادلات التالية:
- إذا تمت إضافة النكهة التجريبية ذات الأهمية إلى الصبغة الحمراء ، فاستخدم (Nred + 0.5Npurple) / (Nred + Nblue + Npurple).
- إذا تمت إضافة الطعم التجريبي إلى الصبغة الزرقاء ، فقم بضبط المعادلة على (Nblue + 0.5Npurple) / (Nblue + Nred + Npurple).
- كرر العمليات الحسابية لجميع الشروط التجريبية والتكرارات.
4. تحسين فحص تفضيل الذوق
- حدد تجريبيا تركيز مؤشرات تلوين الطعام المراد استخدامها حتى لا يؤثر تلوين الطعام على نتيجة فحص الذوق ، على النحو التالي:
- قم بإعداد 4 طعمات باستخدام نفس المركب الأساسي (على سبيل المثال 5 ملي من السكروز) كما هو موضح في الخطوة 2.1 ، ولكن احذف ألوان الطعام.
- أضف 1.3٪ تلوين طعام أحمر إلى أحد المذاق. اصنع المذكرات الثلاثة المتبقية مع تلوين طعام أزرق بتركيزات متفاوتة في كل أنبوب (على سبيل المثال 0.6٪ و 1٪ و 1.3٪).
- أكمل خطوات البروتوكول من 2.2 إلى 3.4 لكل زوج من أزواج التاستانت: 1.3٪ أحمر مقابل 0.6٪ أزرق ؛ 1.3٪ أحمر مقابل 1٪ أزرق و 1.3٪ أحمر مقابل 1.3٪ أزرق.
- كرر الخطوة 4.1.1-4.1.3 بنسب مختلفة من ألوان الطعام الزرقاء حتى يبلغ متوسط مؤشر التفضيلات قيمة 0 (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2).
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: كنقطة انطلاق ، عادة ما يؤدي تلوين الطعام الأحمر بنسبة 1.3٪ إلى جانب تلوين الطعام الأزرق بنسبة 1٪ إلى نتائج جيدة. إذا لم يكن من الممكن مطابقة تركيز مرض من تلوين الطعام الأزرق مع صبغة 1.3٪ ، فيمكن تكرار الخطوة من 4.1.1 إلى 4.1.3 بتركيزات متفاوتة من اللون الأحمر وتركيز ثابت من تلوين الطعام الأزرق.
- قم بتحليل جميع الظروف المراد اختبارها بنفس تركيزات ألوان الطعام المحسنة.
