اختبار الشعرية (CAFE): طريقة لتتبع استهلاك الطعام وتفضيله في ذبابة الفاكهة

الملخص

المصدر: Diegelmann، S.، et al. يقيس اختبار CApillary FEeder تناول الطعام في ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو اختبار CApillary FEeder ، أو CAFE ، وهي طريقة سلوكية تقيس تناول الطعام وتفضيل ذباب الفاكهة غير المقيد. يوضح البروتوكول المميز كيفية إجراء الفحص بأقل قدر من التبخر من الشعيرات الدموية المملوءة بالسائل المستخدمة لتوصيل الطعام وتتبع تناوله.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Diegelmann et al. ، The CApillary FEeder Assay يقيس تناول الطعام في ذبابة الفاكهة السوداء ، J. Vis. Exp. (2017).

< p class = "jove_title" >1. تجميع وتنفيذ اختبار FEeder الشعري

1. إذا لم تكن هناك حاجة للصيام ، فقم بنقل الذباب التجريبي إلى الفحص عن طريق النقر أو عن طريق أنبوب النفخ. تأكد من تضمين ثلاث قوارير تحكم بدون ذباب لتحديد التبخر.
2. قم بإزالة طرف الماصة بعناية (حجم 2 - 20 ميكرولتر) الذي يغلق إحدى الفتحات الخارجية، وأدخل طرفا زجاجيا مملوءا بنهاية سفلية أولا. قم بتأمين الشعيرات الدموية عن طريق وضع طرف الماصة للخلف بجوار الشعيرات الدموية. إذا تم اختبار العديد من المحاليل الغذائية ، كرر هذا الإجراء وفقا لذلك.
3. ضع الأطراف الشعرية داخل جميع القوارير على نفس المستوى لتجنب التحيز الذي يمكن أن يحدث إذا كانت مصادر الطعام موجودة على ارتفاعات مختلفة (3-4 سم من الغطاء) ؛ حافظ على مسافة من ورق الترشيح لمنع تسرب الشعيرات الدموية عن طريق لمس ورق الترشيح عن طريق الخطأ أو اللزوجة المختلفة لمصادر الغذاء.
4. قم بتسمية الطرف العلوي للسائل الملون باستخدام قلم تحديد (علامة_{البداية}). لضمان إمكانية تحديد الشعيرات الدموية المختلفة ، قم بتسميتها بشكل فردي باستخدام رمز اللون أو الشريط.
5. ضع فحوصات CAFE متعددة المعدة داخل صندوق بلاستيكي مع ترصيع شبكي وانقل الصندوق (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ) إلى مكان آمن في ظل ظروف المختبر أو في غرفة مناخ يتم التحكم فيها بدرجة الحرارة والضوء والرطوبة (المعلمات: 25 درجة مئوية ، 60٪ رطوبة نسبية ، 12 ساعة / 12 ساعة دورة فاتحة وظلامية) للفترة التجريبية (على سبيل المثال 3 ساعات أو أيام).
6. عندما يجف ورق الترشيح السفلي إذا تم إجراء الفحص على مدار عدة أيام ، ضع الماء العذب كل 24 ساعة عبر الإسفنج (100 ميكرولتر) للحفاظ على ثبات الرطوبة داخل المقايس. استخدم أربع قوارير منفصلة (ارتفاع 8 سم وقطر 3.3 سم) مملوءة ب 30 مل ddH₂O كأجهزة رطوبة وضعها بجوار فحوصات CAFE في الصندوق البلاستيكي. استخدم غطاءا للصندوق البلاستيكي لإنشاء بيئة يتم التحكم فيها بالرطوبة أثناء التجربة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يحدث تباين أوسع في ظل ظروف المختبر. ومع ذلك ، فمن الممكن إجراء اختبار CAFE في درجة حرارة الغرفة (على سبيل المثال ، في الفصل الدراسي). يتم تشجيع استخدام جهاز الترطيب (ورق الترشيح ، مع أو بدون إسفنجة مبللة ، وقوارير ماء مملوءة وغطاء للصندوق البلاستيكي) لتقليل التبخر (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب).
7. استبدل الشعيرات الدموية بأخرى مملوءة حديثا لإجراء تجارب طويلة الأمد كل 24 ساعة. قم بتدوين الذباب الميت قبل كل فاصل زمني مدته 24 ساعة واستخدم عدد الذباب الحي لحساب الاستهلاك لكل ذبابة للفترة التالية. تخلص من الشعيرات الدموية القديمة بعد قياس تدهور الغضروف المفصلي (انظر 2.1).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: خلال تجربة مدتها 3 ساعات ، بالكاد نرى أي ذباب ميت. خلال دراسة مدتها 4 أيام ، نجد عادة 1-3 ذباب ميت.
8. في نهاية الفحص أو قبل استبدال الشعيرات الدموية، ضع علامة على الغضروف المفصلي السفلي للشعرية (_نهاية العلامة) بقلم تحديد بينما لا يزال اختبار CAFE في الوضع الرأسي. تجاهل البيانات إذا لم تكن_نهاية العلامة أقل من العلامة الأولية (_بداية العلامة). لا تقم بإزالة الغطاء ، فقد يؤدي ذلك إلى تغيير الغضروف المفصلي.
9. قم بإزالة الشعيرات الدموية بعناية من الفحص وتخزينها لجمع البيانات. تحقق مما إذا كان السائل الموجود داخل الشعيرات الدموية قد وصل إلى الطرف السفلي إذا لم يتم تجاهل البيانات ، حيث لم يكن الطعام في متناول الذباب. اجمع جميع الشعيرات الدموية لكل قارورة كمجموعة. أدخل أطراف الماصة غير المقطوعة في جميع الفتحات لمنع الذباب من الهروب. قم بتفكيك الإعداد وغسل القوارير والأغطية والسدادات الإسفنجية في حمام الصابون وجففها طوال الليل في درجة حرارة الغرفة لمزيد من الاستخدام.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تحليل الذباب بعد الفحص. تأكد من امتصاص الطعام بالعين أو تحت مجهر التشريح.
10. كرر التجارب مع نفس الأنماط الجينية في ثلاثة أيام مختلفة على الأقل.

< p class = "jove_title" >2. جمع البيانات وتحليلها

1. قم بقياس المسافة بين_بداية العلامة_ونهاية العلامة على الشعيرات الدموية باستخدام الفرجار أو المسطرة. لنقل البيانات مباشرة إلى جدول بيانات، استخدم الفرجار الرقمي المتصل ب USB (الناقل التسلسلي العالمي) (<فئة قوية="xfig">الشكل 1ه). تخلص من الشعيرات الدموية بعد القياس.
2. ضع في اعتبارك حجم الشعيرات الدموية لحساب امتصاص الطعام أو تبخره. على سبيل المثال ، ضع في اعتبارك الشعيرات الدموية التي يبلغ طولها 73 مم وتحتوي على 5 ميكرولتر من محلول الطعام. يعكس الانخفاض بمقدار 14.6 مم في الغضروف المفصلي امتصاص محلول 1 ميكرولتر. احسب امتصاص الطعام باستخدام الصيغة التالية:
   امتصاص الطعام (ميكرولتر) = المسافة المقاسة (مم) / 14.6 مم
3. لاستبعاد تأثير التبخر على تناول الطعام ، احسب متوسط التبخر في قوارير التحكم الثلاثة (على الأقل) بدون ذباب. اطرح هذه القيمة المتوسطة من القيمة التي حصل عليها الذباب لاستهلاك الطعام.
4. استخدم الصيغة التالية لتحديد إجمالي الاستهلاك لكل ذبابة:
   استهلاك الغذاء (ميكرولتر) = (امتصاص الطعام [ميكرولتر] - فقدان التبخر [ميكرولتر]) / العدد الإجمالي للذباب في القارورة. بالنسبة للتجارب طويلة المدى ، استخدم عدد الذباب على قيد الحياة قبل بدء الفاصل الزمني البالغ 24 ساعة.
5. لحساب الاختلافات في حجم الجسم ، مثل بين ذكور وإناث الذباب ، قم بتطبيع استهلاك الطعام لوزن الجسم (ميكرولتر من الطعام / مجم ذبابة).
6. استخدم البرامج الإحصائية لتحليل البيانات. بالنسبة للبيانات الموزعة بشكل طبيعي ، استخدم اختبارات T الخاصة بالطالب لتحديد الاختلافات بين مجموعتين من الذباب ، واستخدم ANOVA (تحليل التباين) مع اختبارات Tukey Cramer اللاحقة لأكثر من مجموعتين. في حالة الاختيار ، قم بتحليل الاختلافات عن الاختيار العشوائي باستخدام اختبار علامة عينة واحدة غير معلمي.

النتائج

الشكل 1: ذبابة الفاكهة السوداء اختبار الشعيرات الدموية. أ) مقايسة التغذية بالذباب. يوفر ورق الترشيح المبلل الماء في قاع القارورة. يتم توفير أربعة شعيرات دموية أثناء التجربة (طعام أحمر وأزرق اللون في الشعيرات الدموية المعاكسة). لاحظ أن الشعيرات الدموية مثبتة في موضعها بواسطة طرف ماصة ثان، ويتم إغلاق المواضع غير المستخدمة باستخدام أطراف الماصة. يسمح سدادة الرغوة الموجودة في وسط الغطاء بتبادل الهواء...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قوارير (تربية) غرينر بيو ون 960177 www.greinerbioone.com قوارير (فحص CAFE) غرينر بيو ون 217101 www.greinerbioone.com اختبار Lid-CAFE حلقه العمل - - صندوق بلاستيكي ، جدار منخفض بلاستيم 353 www.plastime.it غطاء الصندوق البلاستيكي حلقه العمل - - الشعيرات الدمويه بلوبراند المرجع 7087 07 www.brand.de أطراف الماصة غرينر بيو ون 771290 www.greinerbioone.com دوائر ورق الترشيح واتمان 10 311 804 www.sigmaaldrich.com D (+) - السكروز AppliChem 57-50-1 www.applichem.com الإيثانول المطلق كيماويات VWR 20,821,330 www.vwr.com لون الطعام (أحمر ، E124) المرح 10027 www.backfun.de لون الطعام (أزرق، E133) المرح 10030 www.backfun.de محلول الصابون (CVK 8) CVH هاتف: 103220 www.cvh.de الفرجار الرقمي جارانت 412,616 ريال www.hoffmann-group.com قوارير (تربية) الارتفاع 9.8 سم ، القطر 4.8 سم قوارير (فحص CAFE) الارتفاع 8 سم ، القطر 3.3 سم اختبار Lid-CAFE أنتجت في ورشة عمل جامعية ، تم توفير الرسم الفني
الرجاء النقر هنا لتنزيل هذا الملف. صندوق بلاستيكي ، جدار منخفض تم تصميم ترصيع شبكي بلاستيكي خصيصا لمواضع قارورة 8 × 10 غطاء الصندوق البلاستيكي الأبعاد (37 × 29 × 18 سم) الشعيرات الدمويه معيار DIN ISO 7550 ، إرشادات IVD 98/79 EG ، ينتهي مصقول أطراف الماصة يتم قطع ماصات الدائرة الخارجية حسب الغطاء دوائر ورق الترشيح يعمل قطر 45 مم بشكل جيد إذا تم طيه للقوارير المستخدمة D (+) - السكروز غير ضار الإيثانول المطلق سائل وبخار شديد الاشتعال لون الطعام (أحمر ، E124) غير مذكور لون الطعام (أزرق، E133) غير مذكور محلول الصابون (CVK 8) صابون محايد للرائحة الفرجار الرقمي طعام الذباب القياسي (20 لترا) اجار 160 جرام خميرة البيرة 299.33 غ دقيق الذرة 1,200 جرام دبس 1.6 لتر حمض البروبيونيك 57.3 مل نيباجين 30٪ 160 مل