تحضير شرائح اليرقات: طريقة لتصور الخلايا العصبية الحسية السليمة وخلايا البشرة المرتبطة بها

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Tenenbaum ، CM ، Gavis ، E. R. إزالة الأنسجة العضلية ذبابة الفاكهة من شرائح اليرقات لتحليل التألق المناعي للخلايا العصبية الحسية وخلايا البشرة. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو كيفية تحضير شرائح اليرقات المستخدمة لتصور الخلايا العصبية للتشجير الشجيري الحسي (da) وخلايا البشرة المرتبطة بها. يوضح البروتوكول المميز بالتفصيل كيفية إزالة الأنسجة العضلية من جدار الجسم مع الحفاظ على مورفولوجيا الخلايا ، مما يحسن التلوين المناعي وتصور الخلايا العصبية وخلايا البشرة المحجوبة.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Tenenbaum and Gavis ، إزالة الأنسجة العضلية ذبابة الفاكهة من شرائح اليرقات لتحليل التألق المناعي للخلايا العصبية الحسية وخلايا البشرة ، J. Vis. Exp.(2016).

< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: إجراء إزالة العضلات (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1) هو تعديل للطرق الموصوفة سابقا لتحضير شرائح اليرقات. يتم تحديد الخطوات التي تسبق إزالة العضلات وتتبعها بإيجاز ويتم إحالة القارئ إلى العمل السابق في Brent، et al.، J. Vis. Exp. (2009) و Karim and Moore، J. Vis. Exp. (2011) للحصول على أوصاف أكثر تفصيلا.

< p class = "jove_title" >1. تشريح اليرقة في محلول ملحي بارد

1. قم بإعداد تخفيف العمل من محلول ملحي HL3.1 البارد أو محلول ملحي خال من Ca^{2 +} HL3.1 (الجدول 1). ضع اليرقة في طبق من المطاط الصناعي المصنوع من السيليكون مع ما يكفي من المحلول الملحي البارد لتغطية قاع الطبق.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: نوصي بتجربة استخدام محلول ملحي HL3.1 الخالي من Ca²⁺ مقابل محلول ملحي HL3.1 القياسي أثناء تشريح اليرقات. في حالة عدم وجود الكالسيوم ، تقلص تقلصات عضلات اليرقات بشكل كبير. وبالتالي ، قد يكون من الأسهل معالجة شرائح اليرقات عند تشريحها في محلول ملحي خال من Ca^{2 +}. ومع ذلك ، نجد أن تقلص العضلات يخلق مسافة بين العضلات والبشرة وهذا يمكن أن يسهل إدخال الملقط بين هذه الأنسجة مع تقليل خطر تلف البشرة. نتيجة لذلك ، قد يكون معيار HL3.1 هو الأفضل للحفاظ على سلامة البشرة والخلايا العصبية. نحصل على نتائج جيدة إما مع المحلول الملحي ويترك الخيار للمستخدم.
2. ضع اليرقة مع الجانب البطني لأعلى. يمكن التعرف على السطح البطني لليرقة من خلال أحزمة الأسنان البطنية والجانب الظهري بواسطة أنابيب القصبة الهوائية اليرقاتية الأولية التي تمتد من الأمام إلى الخلف. قم بتمديد اليرقة في الاتجاه الأمامي الخلفي وقم بتثبيت الرأس والذيل على طبق تشريح مطاط من السيليكون باستخدام دبابيس الحشرات. استخدم مقصا ناعما للتشريح للقطع على طول خط الوسط البطني ، بدءا من أحد طرفيه والتقدم نحو الطرف الآخر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يحافظ هذا الاتجاه على المجموعة الظهرية التي تمت دراستها بشكل شائع من الخلايا العصبية da.
3. بعد فتح اليرقة ، قم بتثبيت الزوايا الأربع في طبق التشريح كما لو كنت تفتح كتابا. استخدم الملقط للاستيلاء على الأعضاء الداخلية وإزالتها بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي والأمعاء والقصبة الهوائية. اضبط دبابيس الحشرات بحيث تكون الشرائح مشدودة ولكن ليست ممتدة إلى أقصى حد.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ترتكز العضلات على جدار الجسم عند حدود قطاعية. على الرغم من أن العضلات تغطي معظم جدار الجسم ، إلا أنها غائبة في منطقة ضيقة بالقرب من خط الوسط الظهري.

< ص الفئة = "jove_title" >2. إزالة العضلات

1. حدد موقع خط الوسط الظهري لليرقة ، حيث تغيب الأنسجة العضلية. ضع شقة ملقط واحدة بحيث يمكن إدخالها أسفل الأنسجة العضلية في الاتجاه المسطح الممكن.
2. بدءا من خط الوسط الظهري ، بالقرب من الحدود الأمامية للجزء ، حرك الشق الملقط بعناية بين العضلة والبشرة ، مع الحرص على تقليل التلامس بين الملقط والبشرة.
3. اسحب الملقط لأعلى لكسر ارتباط العضلة بجدار الجسم عند نقطة تثبيت واحدة. كرر هذه العملية لجزء (أجزاء) نصفي الأجزاء المتبقية ذات الاهتمام.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يعمل هذا البروتوكول على تحسين الحفاظ على الجزء الخلفي من كل حقل تغصني خلية عصبية. للحفاظ على الجزء الأمامي من مجال التغصنات ، من الأفضل إدخال شق الملقط في الطرف الخلفي لكل جزء.
4. أعد ضبط دبابيس الحشرات بحيث يتم شد شرائح اليرقات إلى أقصى حد في جميع الاتجاهات.
5. قم بإصلاح الفيليه بينما لا يزال مثبتا على طبق التشريح باستخدام الفورمالديهايد البارد الطازج بنسبة 4٪ في PBS لمدة 25 دقيقة.
6. اشطف 5 مرات في PBS.
7. استخدم الملقط لسحب الأنسجة العضلية بعناية من نقاط التثبيت المتبقية ، مع الحرص على تقليل ملامسة البشرة.
8. قم بفك تثبيت الشرائح وإزالتها من طبق التشريح إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل. قم بتنفيذ جميع خطوات الغسيل والحظر والتلوين المناعي اللاحقة ، كما هو موضح سابقا في Karim and Moore، J. Vis. Exp. (2011).

النتائج

الشكل 1: نظرة عامة على إجراء إزالة العضلات. يتم تشريح اليرقة وتثبيتها في طبق تشريح مطاط الصناعي السيليكوني. لإزالة الأنسجة العضلية ، يتم إدخال شق ملقط واحد بين العضلات وطبقة خلايا البشرة ، بدءا من خط الوسط الظهري بالقرب من حدود الجزء (2.2). يتم سحب الملقط لأعلى لكسر التعلق بين العضلات وجدار الجسم (2.3). يتكرر هذا للأجزاء ذات الأهمية ثم يتم تثبيت اليرقة في الفورمالديهايد (2.5). بعد التثبيت ، يتم استخدام الملقط لفصل الأنسجة...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملاقط دومون # 5 علوم المجهر الإلكتروني 72701-د مقص دقيق ، 8 سم ، مستقيم ، شفرات 5 مم ، أطراف 0.1 مم أدوات الدقة العالمية 14003 Sylgard 184 مجموعة المطاط الصناعي سيليكون داو كورنينج 3097358-1004 لتشريح الألواح دبابيس حشرات أوسترليتز ، 0.1 مم أدوات العلوم الدقيقة 26002-10 مصدر الضوء Fostec 8375 مجموعة التكنولوجيا الحرفية 62792-4