تشريح الغدة الليمفاوية لليرقات: عزل العضو المنتج لذبابة الفاكهة الدموية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Reimels ، T. A. and Pfleger ، CM طرق لفحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2016).

يصف هذا الفيديو ذبابة الفاكهة الغدة الليمفاوية - الموقع الأساسي لتكون الدم في يرقة الذبابة - ويظهر مثالا على بروتوكول تشريح وتركيب العضو للكيمياء المناعية والتصوير الفلوري.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Reimels and Pfleger ، طرق فحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في ذبابة الفاكهة يرقات ، J. Vis. Exp. (2016).

فئة

1. الكيمياء المناعية للغدة الليمفاوية اليرقات

< p class = "jove_content" >< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: تقع الغدة الليمفاوية بطول الثلث تقريبا من الطرف الأمامي لليرقة أسفل الدماغ قليلا على الجانب الظهري. (انظر السهم في <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1ب.) تحيط الغدة الليمفاوية بالوعاء الظهري ويمكن تشريحها بسهولة متصلة بخطافات الفم أو بالدماغ. الغدد الليمفاوية من النوع البري والطور الثالث هي هياكل صغيرة جدا. يبلغ طول الفصوص الأولية حوالي 100-200 ميكرومتر. (انظر <فئة قوية = "xfig" > الشكل 2أ.)

1. للحصول على يرقات من نفس مرحلة النمو تقريبا لهذا الفحص ، قم بتقييد جمع البيض عن طريق السماح للإناث بوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2 إلى 6 ساعات.
2. تسلخ الغدة الليمفاوية
   1. لكل حالة تجريبية ، أضف 1 مل 1x PBS (الجدول 1) إلى بئر واحد من صفيحة 24 بئرا.
   2. أضف قطرة واحدة من 0.1٪ PBST (الجدول 1) إلى كل بئر باستخدام ماصة نقل يمكن التخلص منها.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يضاف المنظف ، مثل Tween 20 ، لخفض التوتر السطحي ، مما يسمح للأنسجة بالغرق في قاع البئر.
   3. ضع الطبق بشكل مسطح على الثلج.
   4. اجمع اليرقات في تشريح آبار الأطباق المملوءة ب 1x PBS.
   5. ضع وسادة تشريح نظيفة على قاعدة مجهر مجسمة مضيئة. استخدم ماصة نقل يمكن التخلص منها لوضع قطرات صغيرة بنسبة 0.01٪ PBST (الجدول 1) على الوسادة. انقل يرقة واحدة إلى قطرة PBST للتشريح.
   6. امسك اليرقة بزوج واحد من الملقط بطول ربع تقريبا من الطرف الخلفي ، الجانب الظهري لأعلى.
   7. استخدم زوجا آخر من الملقط للإمساك بالبشرة مباشرة أمام الملقط الذي يحمل اليرقة. اسحب البشرة برفق باتجاه الطرف الأمامي حتى تنكشف خطافات الفم.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الهدف هو تقشير البشرة دون إزعاج أي هياكل داخلية.
   8. حرر البشرة واستخدم كلا الملقطين لتقطيع اليرقة إلى قسمين. قم بإزالة الطرف الخلفي من قطرة PBST.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا لم تتقشر البشرة على طول الطريق إلى خطافات الفم ، فقم بقطع اليرقة إلى قسمين وإزالة الطرف الخلفي. استخدم زوجا واحدا من الملقط لتثبيت حافة البشرة ، واستخدم الزوج الآخر من الملقط لدفع خطافات الفم عبر الفتحة. سيؤدي ذلك إلى عكس بشرة وفضح خطافات الفم. يمكن استخدام هذا كطريقة تشريح بديلة أيضا.
   9. استخدم زوجا واحدا من الملقط لتثبيت البشرة (إما البشرة البطنية أو رفرف البشرة الظهرية أو كليهما) لتحقيق الاستقرار.
   10. استخدم زوجا آخر من الملقط للاستيلاء على خطافات الفم المكشوفة وسحبها برفق للخارج.
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى فصل البشرة عن الهياكل الداخلية. من الناحية المثالية ، ستظل الأقراص الخيالية للعين / الهوائي والدماغ والغدة الحلقية والغدة الليمفاوية المحيطة بالوعاء الظهري متصلة بخطافات الفم.
   11. بينما لا تزال تمسك خطافات الفم ، قم بإزالة الهياكل غير المرغوب فيها بعناية مثل الغدد اللعابية والجسم الدهني والأمعاء.
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا انفصل الدماغ عن خطافات الفم، فقد تظل الغدة الليمفاوية مرتبطة بالدماغ وتجمعها معه. في هذه الحالة، أمسك الحبل العصبي البطني بدلا من خطافات الفم.
   12. باستخدام خطافات الفم أو الحبل العصبي البطني كمقبض ، انقل المركب المقطوع الذي يحتوي على الغدة الليمفاوية إلى البئر على الجليد. لا تتجاوز 30 دقيقة قبل التثبيت.
3. التثبيت والكيمياء المناعية
   1. ضع اللوحة المكونة من 24 بئرا على قاعدة المجهر المجسم.
   2. استخدم ماصة p200 لإزالة PBST بعناية من البئر.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الآبار المجاورة الفارغة مفيدة لإيداع النفايات مؤقتا.
   3. أضف برفق 200 ميكرولتر 3.7٪ فورمالديهايد (الجدول 1) أسفل جانب البئر وقم بتدوير اللوحة للتأكد من أن الأنسجة المقطوعة مغمورة تماما.
   4. أعد الطبق إلى الثلج لمدة 30 دقيقة. إذا كانت الغدد الليمفاوية تعبر عن بروتين (بروتينات) الفلورسنت ، فاحتفظ بالصفيحة مغطاة لمنع التبييض الضوئي.
   5. استخدم ماصة p200 لإزالة المثبت بعناية.
   6. اغسل بإضافة 200 ميكرولتر 1x PBS إلى البئر ووضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم ماصة p200 لإزالة PBS.
      بعناية <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن ترك الغدد الليمفاوية الثابتة على الجليد في PBS حتى يتم تشريح الغدد الليمفاوية لجميع الحالات التجريبية وتثبيتها.
   7. كرر خطوات الغسيل مرتين أخريين.
   8. أضف 200 ميكرولتر من محلول النفاذية (الجدول 1) إلى البئر. ضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 45 دقيقة عند RT.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: 45 دقيقة هي "المعيار الذهبي" لنفاذية الغدد الليمفاوية ولكن المؤلفين حققوا نجاحا بعد 20 دقيقة فقط.
   9. قم بإزالة المحلول باستخدام ماصة p200.
   10. تخفيف الجسم المضاد الأولي بمحلول الأجسام المضادة (الجدول 1) وفقا لمواصفات المزود. أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأولية إلى البئر وتأكد من غمر الأنسجة المقطعة بالكامل. احتضن عند 4 درجات مئوية طوال الليل.
   11. استخدم ماصة p200 لإزالة الجسم المضاد الأساسي.
   12. اغسل بإضافة 200 ميكرولتر 1x PBS إلى البئر ووضع اللوحة على شاكر مداري لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. استخدم ماصة p200 لإزالة PBS بعناية.
   13. كرر خطوات الغسيل مرتين أخريين.
   14. تمييع الجسم المضاد الثانوي بمحلول الأجسام المضادة وفقا لمواصفات المزود. أضف 300 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية إلى البئر وتأكد من غمر الأنسجة المقطعة بالكامل. احتضان على شاكر مداري لمدة 2 ساعة على الأقل في RT.
   15. استخدم ماصة p200 لإزالة الجسم المضاد الثانوي وغسلها كما هو موضح في الخطوتين 1.3.12 و 1.3.13. لا تقم بإزالة PBS بعد الغسيل النهائي.
4. تركيب الغدة الليمفاوية
   1. نظف شرائح المجهر الزجاجي باستخدام 70٪ من الإيثانول (الجدول 1) ومناديل المناديل.
   2. لكل حالة تجريبية ، ضع قطرة واحدة من المخزن المؤقت للتركيب (الجدول 1) على الشريحة الزجاجية.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: شرطان يتناسبان مع شريحة واحدة. يعتمد حجم المخزن المؤقت المتصاعد على عدد الغدد الليمفاوية المراد تركيبها. استخدم 2 ميكرولتر لما يقرب من 18-20 غدد ليمفاوية ، و 1 ميكرولتر لمدة 10-12 ، و 0.5 ميكرولتر لمدة 5 غدد ليمفاوية أو أقل.
   3. ضع شريحة المجهر على قاعدة مجهر مجسمة مضيئة.
   4. لما يصل إلى حالتين في وقت واحد ، انقل جميع الغدد الليمفاوية من البئر إلى المخزن المؤقت المتصاعد باستخدام ملقط ، باستخدام خطافات الفم أو الحبل العصبي البطني كمقبض.
   5. باعد بين الأنسجة المقطوعة بالتساوي في شكل دائري أو مستطيل ، مع نشر المخزن المؤقت المتصاعد في هذه العملية.
   6. لكل من الأنسجة التي تم تشريحها ، بشكل فردي ، حرك ملقطا واحدا من الملقط أسفل الوعاء الظهري واسحب برفق نحو محيط المخزن المؤقت المتصاعد.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: سيؤدي ذلك إلى سحب الغدة الليمفاوية من بقية الأنسجة المقطوعة وتسطيح الغدة الليمفاوية على الزجاج.
   7. باستخدام ملقط واحد من الملقط وحركة النشر ، قم بقطع الوعاء الظهري بين الغدة الليمفاوية والدماغ.
   8. انقل باقي الأنسجة المقطوعة إلى الجانب الآخر من الغدة الليمفاوية ، عند الحافة الخارجية للمخزن المؤقت.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستشكل الأنسجة غير المرغوب فيها في النهاية محيطا حول الغدد الليمفاوية وتكون بمثابة دعم يرتكز عليه الغطاء.
   9. كرر حتى يتم فصل جميع الغدد الليمفاوية عن الأنسجة المقطوعة، مع الاحتفاظ بأحد الأنسجة التشريح غير المرغوب فيها لوضعها في المنتصف.
   10. خذ غطاء بين إصبعين. تأكد من خلو الغطاء من الغبار وبصمات الأصابع. إذا لزم الأمر ، استخدم مناديل مناديل ورقية و 70٪ إيثانول لتنظيف الغطاء.
   11. للتأكد من أن حافة الغطاء موازية لحافة الشريحة الزجاجية ، قم بخفض الغطاء بعناية فوق المخزن المؤقت للتثبيت.
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تخزين شرائح المجهر عند 4 درجات مئوية قبل التصوير. يعتمد الحد الأقصى لوقت التخزين على استقرار الأجسام المضادة المستخدمة. يمكن شطف ألواح 24 بئرا وإعادة استخدامها.

2. التصوير

1. صورة الخلايا الدموية الثابتة والغدد الليمفاوية المثبتة على مضان قياسي مناسب أو مجهر متحد البؤر عند تكبير 20X أو أعلى وفقا لدليل التشغيل الخاص بالشركة المصنعة. صور اليرقات الكاملة على مجهر مجسم قياسي بتكبير 2X وفقا لدليل التشغيل الخاص بالشركة المصنعة.
2. اتبع تعليمات مزود البرنامج لتفكيك الالتواء ، إذا رغبت في ذلك.

النتائج

الشكل 1: في الجسم الحي ميلانيزة الخلايا البلورية أ) تم وضع اليرقات بشكل فردي في أنابيب PCR قبل التسخين. تشير الأسهم الحمراء إلى اليرقات غير الموجودة في قاع الأنابيب. ب) نمط ميلانة الخلايا البلورية النموذجي بعد التسخين ، والذي يكشف أحيانا عن الغدة الليمفاوية (السهم ؛ الجانب الظهري الموضح ، الأمامي يسار). يمثل شريط المقياس 1 مم

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أقراص PBS MP الطب الحيوي 2810305 تشريح الطبق كورنينج 7220-85 أنبوب الطرد المركزي الدقيق دينفيل سي 2170 وسادة تشريح سيليكون ، مصنوعة من مجموعة Sylgard 184 كرايدن (موزعة من خلال فيشر) NC9644388 (رقم كتالوج فيشر) مصنوع في طبق بتري عن طريق خلط مكونات مجموعة المطاط الصناعي سيلجارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مجهر مجسمة Morrell Instruments (موزع نيكون) mna42000 ، MMA36300 طرازات نيكون SMZ1000 و SMZ645 مناديل الأنسجة VWR 82003-820 ملقط علوم المجهر الإلكتروني 72700-د.ز ماصة P200 إيبندورف 3120000054 فورمالدهيد صياد بي ت 531-500 تريتون صياد بي بي 151-500 توين 20 صياد بي ت 337-500 ألبومين مصل الأبقار روكي ماونتن بيولوجيز بي إس إيه - بي إس إتش - 01 ك مصل الماعز العادي سيغما G9023-10ML مصل الحمار العادي سيغما D9663-10ML 200 دليل على الإيثانول VWR V1001 إن بروبيل غالات MP الطب الحيوي 102747 الجلسرين VWR إم -4750 DAPI (4 '، 6-diamidino-2-phenylindole) صياد 62248 زجاج غطاء مجهري ، دائري 18 مم صياد 12-545-100 شرائح المجهر الزجاجي صياد 22-034-980 طبق 24 بئر كورنينج 351147 ماصة نقل يمكن التخلص منها صياد 13-711-9 صباحا المجهر الفلوري زييس كاميرا Axio Imager.Z1