ذبابة الفاكهة تشريح دماغ البالغين: طريقة في علم الأعصاب للذباب

الملخص

المصدر: Kelly، S.M.، et al. تشريح وتلوين مناعي فلورسنت لجسم الفطر والخلايا العصبية المستقبلة للضوء في أدمغة ذبابة الفاكهة السوداء البالغة. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو كيفية تشريح وعزل دماغ ذبابة الفاكهة البالغ - وهو إجراء ضروري لتصور العضو ، والذي تحجبه البشرة والعين والأنسجة القصبة الهوائية. يوضح بروتوكول المثال عرضا توضيحيا مفصلا ينتج عنه مستحضرات عالية الجودة يمكن استخدامها في التلوين المناعي وطرق التصوير في ذبابة الفاكهة البيولوجيا العصبية.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Kelly et al. ، تشريح وتلوين الفلورسنت المناعي لجسم الفطر والخلايا العصبية المستقبلة للضوء في أدمغة ذبابة الفاكهة السوداء البالغة ، J. Vis. Exp. (2017).

< p class = "jove_title" >1. إعداد محطة التشريح

1. ضع المجهر المجسم ومصدر الضوء مع معقوفة من الألياف البصرية المرفقة على منضدة كبيرة. لتعزيز حركات اليد الثابتة وتقليل "اهتزاز" اليد أثناء التشريح ، من الضروري توفر مساحة كافية لمسند اليد والذراع حول المجهر. تأكد من وجود ما يقرب من 8-10 بوصات على جانبي المجهر و 4-6 بوصات بين قاعدة المجهر وحافة المقعد.
2. املأ 2 أو 3 آبار من طبق زجاجي مكون من 9 آبار أو 3 آبار ب 1.0 مل من المخزن المؤقت PTN (0.1 متر من محلول فوسفات الصوديوم الرقم الهيدروجيني 7.2 ، 0.1٪ خافض للتوتر السطحي غير أيوني ، انظر جدول المواد للحصول على مكونات عازلة كاملة) وضعها بجوار محطة التشريح على الجليد. سيتم نقل الأدمغة التي تم تشريحها حديثا إلى هذا الطبق وتخزينها حتى خطوة التثبيت.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا كان التصوير الحي مطلوبا ، فيجب أن يكون المخزن المؤقت للتشريح 1x محلول ملحي مخزن للفوسفات (PBS) أو مخزن HL3. إذا كان توطين البروتين داخل الخلايا مطلوبا ، فيمكن أيضا استخدام PBS كمخزن مؤقت بديل للتشريح والتثبيت. بعد التثبيت ، يجب بعد ذلك إجراء نفاذية أغشية الخلايا باستخدام غسالات PTN التي تحتوي على 0.1٪ أو 0.3٪ منظف غير أيوني.
   1. إذا تم استخدام PBS للتشريح والتثبيت ، فيجب شطف أطراف الماصة مرة واحدة على الأقل باستخدام مخزن مؤقت يحتوي على منظف (مثل PTN) لمنع الأدمغة من الالتصاق بأطراف الماصة البلاستيكية أثناء نقلها إلى أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.
3. باستخدام طبق بتري زجاجي أو بلاستيكي فارغ مقاس 35 مم ، قم ببناء طبق تشريح يحتوي على مطاط معدني سيليكون. باختصار ، امزج مكونات المطاط الصناعي وفقا لتوجيهات الشركة المصنعة ، واسكبها في أطباق مقاس 35 مم ، واتركها تتبلمر طوال الليل على سطح مستو. يجب استخدام المطاط الصناعي الذي يحتوي على أطباق تشريح لحماية الأطراف الدقيقة لملقط التشريح ، والتي يمكن أن تتلف بسهولة إذا تم التلامس بين الملقط وسطح صلب ، مثل طبق زجاجي. كما نشتري بانتظام أطباق مطلية بالسيليكون متوفرة تجاريا من تجار التجزئة عبر الإنترنت. لزيادة التباين أثناء التشريح ، تعتبر أطباق تشريح المطاط الصناعي المصنوعة من السيليكون التي تحتوي على الفحم المعطل (وبالتالي الملون باللون الأسود) مفيدة بشكل خاص.

2. إجراء تشريح الدماغ للبالغين

1. تخدير D. melanogaster البالغ من 3 إلى 5 أيام مع ثاني أكسيد الكربون₂ أو باستخدام الثلج. في حالة استخدام الثلج ، ضع القارورة التي تحتوي على الذباب رأسا على عقب (قم بتوصيل الطرف لأسفل) في دلو ثلج لمدة ~ 5 دقائق. وضع القارورة في الجليد رأسا على عقب يمنع الذباب من الاستقرار في الطعام. بمجرد تخدير الذباب ، ضع الذباب على وسادة معدنية باردة أو طبق بتري يجلس في الجليد أو على وسادة ذبابة تنبعث منها ثاني أكسيد الكربون₂. في حالة تشريح الأدمغة لتحليل التنكس العصبي ، يمكن أيضا استخدام الذباب الأكبر سنا.
2. ضع كمية صغيرة (150 - 200 ميكرولتر) من PTN في وسط طبق التشريح باستخدام ماصة نقل أو ماصة p200 لإنشاء "فقاعة" من PTN. ضع طبق التشريح تحت المجهر المجسم واضبط الإضاءة والتركيز بحيث تملأ فقاعة PTN مجال الرؤية وتضيء بشكل موحد.
3. تلاعب بالذباب بحيث يكون "بطنه لأعلى" (أي الجانب البطني لأعلى) أثناء الاستلقاء على المعدن أو وسادة ثاني أكسيد الكربون₂.
4. باستخدام زوج واحد من الملقط # 5 ، أمسك بطن الذبابة المراد تشريحها ، واحتفظ بالذبابة ، واغمرها تماما في PTN على طبق التشريح.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة لبقية البروتوكول ، يجب تنفيذ جميع الخطوات أثناء غمر الرأس في PTN.
5. باستخدام زوج ثان من ملقط # 5 ، أمسك قاعدة خرطوم الذبابة واسحب زوجين من الملقط بعيدا عن بعضهما البعض لفصل رأس الذبابة عن الجسم. تخلص من البطن والصدر. خلال هذه الخطوة ، من الأهمية بمكان عدم تحرير الرأس والسماح له بالطفو على سطح PTN. بمجرد أن يطفو الرأس ، قد يكون من الصعب جدا الإمساك به مرة أخرى دون سحق الدماغ.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: باستخدام هذه الطريقة ، يتم قطع الروابط بين الدماغ والحبل العصبي البطني. إذا كانت هناك حاجة إلى وصلات سليمة بين هذه المناطق من الجهاز العصبي المركزي ، فيجب اتباع بروتوكول تشريح بديل. إذا انفصل خرطوم عن رأس الذبابة قبل إزالة الرأس ، فسيكون هناك ثقب حيث كان خرطوم. في هذه الحالة ، أمسك رأس الذبابة على حافة الفتحة بالقرب من عين واحدة. ثم قم بإزالة الرأس باستخدام كمية معتدلة من القوة أثناء سحب زوجي الملقط بعيدا عن بعضهما البعض. في بعض الأحيان ، عند إزالة الرأس من الجسم ، يظل الحبل المعضمي و / أو الحبل العصبي البطني متصلا بالرأس ويجب إزالته قبل الاستمرار في التشريح.
6. بينما يمسك زوج واحد من الملقط بالخرطوم ، يجب أن يمسك الزوج الثاني بالحافة الإنسية لعين الذبابة اليمنى. ببطء ، اسحب الملقط بعيدا عن بعضها البعض. يجب تنفيذ هذه الخطوة بكمية صغيرة من القوة الجانبية الثابتة. عندما تتحرك الملقط ببطء بعيدا عن بعضها البعض ، يجب أن يبتعد خرطوم عن الرأس ويخلق ثقبا مركزيا في بشرة الرأس. تخلص من خرطوم بالزوج الأول من الملقط دون تحرير الجزء الإنسي من العين اليمنى من الزوج الثاني.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: البالغ D. melanogaster الدماغ في المنطقة الذيلية (أي الخلفية / الخلفية) من رأس الذبابة. وبالتالي ، يجب تجنب الإمساك بتلك المنطقة من الرأس. من الناحية المثالية ، يجب أن يتم الإمساك مباشرة بالجزء المنقاري (أي الأمامي) من الرأس بالقرب من شبكية العين الإنسية مباشرة. يجب أن يكون الدماغ والقصبة الهوائية المرتبطة به مرئيين الآن من خلال الفتحة المركزية في البشرة. في هذا الوقت ، يمكن إزالة أي خيوط خيوطية بيضاء من القصبة الهوائية بارزة من الحفرة والتخلص منها.
7. باستخدام الزوج الثاني من الملقط ، أمسك الحافة الإنسية لشبكية العين اليسرى (عند حافة الثقب المركزي في بشرة الرأس). لإزالة شبكية العين والبشرة المرتبطة بها ، اسحب الملقط ببطء بعيدا عن بعضها البعض بزاوية 180 درجة. عندما تنفصل الشبكية عن الفص البصري الأساسي ، يجب أن تشعر بانخفاض طفيف في التوتر. استمر ببطء لمنع تمزق الفص البصري.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قد يؤدي فصل الملقط بسرعة كبيرة خلال هذه الخطوة إلى تمزق الفص البصري أو تعطيل هياكل جسم الفطر. في بعض الأحيان ، ستتم إزالة البشرة ولكن ستظل أجزاء من شبكية العين متصلة بالفص البصري. في حالة تصوير أجسام الفطر ، ليس من الضروري تماما إزالة شبكية العين بأكملها. ومع ذلك ، قد يتطلب تحليل مناطق الدماغ الأخرى (مثل تعصيب الخلايا العصبية في الشبكية في فصوص الدماغ البصرية) إزالة شبكية العين بالكامل كما هو موضح بواسطة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: نظرا لأن شبكية العين تنفصل ببطء عن الفص البصري الأساسي للدماغ ، يجب أن يكون الفص البصري مرئيا كبنية بيضاء غير شفافة مغطاة بالقصبة الهوائية البيضاء الخيطية. بمجرد إزالة شبكية واحدة ، يمكن التخلص منها. عند تحليل مسار الخلايا العصبية في الشبكية ، يجب توخي الحذر بشكل خاص أثناء هذه الخطوة لمنع تلف الفص البصري. يتوفر أيضا بروتوكول إضافي يركز على التشريح والتصوير المباشر للخلايا العصبية المستقبلة للضوء.
8. الآن ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من القصبة الهوائية المرئية بعناية. قد تحتوي القصبة الهوائية بالفعل على الهواء أو تمتلئ به لاحقا ، مما يتسبب في طفو الأدمغة ، ومن المحتمل أن تضيع أثناء خطوات التلوين المناعي اللاحقة. لإزالة القصبة الهوائية ، التقطها من الدماغ باستخدام زوج حاد جدا من ملقط # 5.
9. قم بإزالة الشبكية المتبقية والبشرة المحيطة بها باستخدام كلا الزوجين من الملقط لفهم المنطقة الإنسية لشبكية العين اليسرى. قم بتمزيق شبكية العين بعناية إلى نصفين لإزالة قطع من شبكية العين والبشرة. في بعض الحالات ، تكون إزالة البشرة المتبقية دون سحق الدماغ صعبة بشكل خاص. في هذه الحالات ، وجدنا أنه يمكن بدلا من ذلك الإمساك بالخيوط المتبقية من الحبل العصبي البطني بواسطة زوج واحد من الملقط بينما يتم استخدام الزوج الآخر من الملقط لإزالة آخر بشرة بعناية.
10. باستخدام ماصة p200 ، انقل الأدمغة المقطوعة إلى بئر واحد من طبق 9 أو 3 آبار يحتوي على PTN. يجب تجميع أدمغة نفس النمط الجيني معا في نفس البئر والاحتفاظ بها على الجليد. يجب إصلاح أنسجة المخ في غضون ساعة واحدة من التشريح. يمكن إصلاح الأدمغة على دفعات صغيرة وتجميعها إذا كان هناك حاجة إلى عدد أكبر من الأدمغة. في معظم الظروف ، يمكن للباحث المتمرس عادة تشريح الدماغ ونقله إلى طبق جمع الزجاج في حوالي 3-5 دقائق.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ملقط / ملاقط التشريح المجهري تيد بيلا 505-نيو متر أطباق سيلجارد أجهزة النظم الحية DD-50-S-BLK متاح من amazon.com Na فوسفات عازلة أحادية القاعدة سيغما S3139 تريتون × 100 سيغما X100-100 مل مجهر مجسمة Leica S6D مع مصدر ضوء KL300 LED طبق 9 آبار (طبق بقعة) VWR 89090-482 طبق 35 مم جينيسي العلمية 32-103 سيلجارد صياد 50-366-794 كيمويب صياد 06-666 PTN المخزن المؤقت 0.1 مليون فوسفات الصوديوم ، درجة الحموضة 7.2 ، 0.1٪ تريتون-X-100 ، عادة ما تشكل 0.5 لتر من عازلة NaPhosphate 0.1M و aliquote 50 مل في المرة الواحدة حسب الحاجة