عد وحدات تشكيل المستعمرة (CFUs): تحديد البكتيريا من أجسام الذباب

الملخص

المصدر: Koyle، M. L.، et al. تربية ذبابة الفاكهة السوداء تحت ظروف محورية وعاطفية حيوية. J. Vis. Exp. (2016).

ذبابة الفاكهة تؤثر على نمو ومناعته وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا الفيديو طريقة لقياس البكتيريا من الذباب عن طريق تحديد وحدات تكوين المستعمرة من مستحضرات الجسم بالكامل. يوضح البروتوكول المميز هذه التقنية مع الذباب ، الذي يتم تربيته في ظل ظروف الجنوتبيوتيك باستخدام أربعة أنواع بكتيرية.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Koyle et al. ، تربية ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء تحت ظروف أكسينيك وجينوتوبيوتيك ، J. Vis. Exp. (2016).

< ص الفئة = "jove_title" >1. بيض منزوع الفصوص ونقله إلى نظام غذائي معقم

1. قم بإعداد خزانة السلامة الحيوية عن طريق رش الداخل (بما في ذلك الجوانب) بنسبة 70٪ من الإيثانول. امسح الجزء السفلي بمنديل مختبر ، وقم بتعقيم الغطاء بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة ~ 15 دقيقة. تعقيم جميع المستلزمات غير البيولوجية (أكواب العينات ، وفرشاة الرسم ، والملقط ، وحاوية النفايات ، و 400 مل من الماء المعقم ، و 100 مل من هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪) عن طريق الرش بالإيثانول ووضعها على الفور في خزانة السلامة الحيوية. تعقيم بضوء الأشعة فوق البنفسجية لمدة 15 دقيقة.
2. ابدأ أول غسلة من 2 هيبوكلوريت الصوديوم عن طريق وضع الجلبة مع البيض في كوب عينة سعة 120 مل أو حاوية معقمة أخرى. صب ببطء ~ 90 مل من محلول هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ في الجلبة حتى أسفل الحافة مباشرة.
3. اشطف البيض لمدة 2.5 دقيقة. أعد تعليق البيض بشكل دوري باستخدام الملقط لتحريك الجلبة لأعلى ولأسفل في محلول هيبوكلوريت.
4. انقل الجلبة مباشرة إلى كوب عينة ثان ، مملوء مسبقا بمبيض 90 مل ، داخل خزانة السلامة الحيوية.
5. كرر الخطوة 1.3 داخل خزانة السلامة البيولوجية. في نهاية علاج التبييض الثاني ، يجب أن يبدأ البيض في الالتصاق بجوانب البطانة.
6. قم بتنفيذ الخطوات 1.7-1.8 في خزانة السلامة البيولوجية.
7. تخلص من المبيض واغسل الجلبة بالماء المعقم 3 مرات. أعد تعليق البيض عدة مرات أثناء كل غسيل عن طريق تحريك الجلبة بالملقط. بحلول نهاية الغسيل الثالث ، يجب ربط معظم البيض بجانب البطانة.
8. باستخدام فرشاة رسم معقمة بالإيثانول ، انقل البيض من جانب الجلبة إلى النظام الغذائي المعقم. انقل البيض بشكل فردي أو على دفعات صغيرة. اهدف إلى 30-50 بيضة لكل قارورة. اترك الأغطية فضفاضة للسماح للأكسجين بالدخول إلى الأنبوب. إذا كانت القوارير ستظل محورية ، فقم بنقلها إلى حاضنة الحشرات. خلاف ذلك ، أضف البكتيريا على النحو التالي.

< p class = "jove_title" >2. اصنع الذباب الجنوتوبيوتيك باستخدام 4 أنواع بكتيرية

1. تحضير البكتيريا
   1. قم بإعداد خزانة معقمة للسلامة الحيوية مع الإمدادات اللازمة (الماصات وصناديق أطراف الماصة وأنابيب الطرد المركزي المعقمة ومرق MRS ورفوف أنبوب الاختبار) كما في الخطوة 1.1. امسح الجزء الخارجي من أنابيب الاختبار بمنديل مختبر مبلل بالإيثانول قبل وضعه في خزانة السلامة الحيوية.
   2. بيليه البكتيريا عن طريق نقل 500 ميكرولتر من النمو بين عشية وضحاها إلى أنبوب ميكرو فوج معقم. إذا كانت كثافة البكتيريا منخفضة ، أضف ما يصل إلى 1.5 مل إلى كل أنبوب أو قم بإزالة المادة الطافية بالتتابع وأضف مزرعة إضافية إلى نفس الأنبوب. قم بإزالة العينات من خزانة السلامة الحيوية وجهاز الطرد المركزي لمدة 10 دقائق عند 10,000 × جم. استخدم أطراف المرشح لتجنب التلوث بين العينات.
   3. تحديد كثافة كل ثقافة بقياس_{OD 600}. في حالة استخدام قارئ ألواح متعدد الآبار ، انقل 200 ميكرولتر من كل ثقافة إلى صفيحة 96 بئرا في تخفيفات 1 و 2 و 4 أضعاف.
   4. تحديد مقدار mMRS لتخفيف كل حبيبات خلية (2.1.2) باستخدام مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة والمعادلات التالية. خطط لإضافة ما يكفي من المرق لتلقيح 50 ميكرولتر لكل قارورة ذبابة.
      1. اجمع قراءات OD₆₀₀ لتخفيف 1: 1 و 1: 2 و 1: 4 لكل ثقافة بكتيرية على مقياس الطيف الضوئي لقراءة اللوحة. حدد التخفيف لكل سلالة بكتيرية تنتج قيمة OD₆₀₀ بين 0.1 و 0.2 واستخدم هذه القيمة وعامل التخفيف المقابل لها ك "O" و "D" في الصيغتين الواردة في 2.1.4.2 أو 2.1.4.3.
      2. إذا كنت تستخدم الأنواع الأربعة الموضحة هنا ، فقم بتطبيع الخلايا إلى وحدة تشكيل مستعمرة مكافئة (CFU) / مل كثافات (تحويل OD₆₀₀ إلى CFU تم تحديده سابقا في Newell and Douglas ، Appl Environ Microbiol. (2014)) باستخدام هذه المعادلة:
         E = ((O-B) × V × D) / C
         حيث E = حجم لإعادة تعليق الحبيبات في (μl) ، O = OD₆₀₀ بكتيريا ، B = OD₆₀₀ وسائط فارغة ، D = تخفيف الطي ، V = ميكرولتر ثقافة بكتيرية قبل الطرد المركزي ، C = OD₆₀₀ من ثابت محدد مسبقا. راجع ملف التعليمات البرمجية التكميلية للحصول على أمثلة على العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات. بالنسبة لمقاييس الطيف الضوئي التي فارغة تلقائيا ، استخدم "O" بدلا من "O-B".
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الثوابت المحددة مسبقا (وحدات OD₆₀₀, تطبيع إلى 10⁷ CFU ^ml-1, الثوابت المشتقة في Newell and Douglas, Appl Environ Microbiol. (2014)) هي كما يلي: A. tropicalis (0.052) ، A. pomorum (0.038) ، L. brevis (0.056) ، L. plantarum (0.077).
      3. في حالة استخدام أنواع بكتيرية أخرى (لا يتوفر ثابت CFU / OD₆₀₀) ، قم بتطبيع الكثافة إلى OD₆₀₀ = 0.1 باستخدام هذه المعادلة:
         E = ((O-B) × V × D) / 0.1 OD₆₀₀
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: الوحدات هي نفسها كما في الخطوة 2.1.4.2. راجع ملف التعليمات البرمجية التكميلية للحصول على أمثلة على العمليات الحسابية باستخدام هذه المعادلات.
   5. في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة المادة الطافية بطرف ماصة وأعد تعليق الحبيبات في mMRS أو PBS الطازج كما هو محسوب في الخطوة 2.1.4.2.
2. تلقيح البكتيريا
   1. انقل 50 ميكرولتر من البكتيريا إلى الأنابيب المخروطية ذات النظام الغذائي المعقم والبيض الممزق في خزانة السلامة الحيوية. أضف البكتيريا بعد نقل البيض لمنع التلوث بين القوارير.
   2. ضع الأنابيب الملقحة في حاضنة عند 25 درجة مئوية.

فئة

3. قياس حمل / اختبار CFU للعقم

1. لقياس حمل CFU في متجانسات الذباب لكامل الجسم ، انقل 5 ذباب (5-7 أيام بعد الإغلاق) إلى أنبوب ميكروفوجي سعة 1.7 مل يحتوي على 125 ميكرولتر من حبات السيراميك و 125 ميكرولتر من مرق mMRS. تجانس الذباب باستخدام مجانس الأنسجة لمدة 30 ثانية بسرعة 4.0 م / ثانية.
   1. بدلا من ذلك ، احذف الخرز وتجانس يدويا في أنابيب الطرد المركزي الدقيقة مع المدقات البلاستيكية لمدة 1 دقيقة.
   2. في حالة تحديد كمية ميكروبات الأمعاء ، قم بتعقيم الذباب السطحي لإزالة الميكروبات الخارجية. نقل الذباب إلى أنبوب طرد مركزي دقيق يحتوي على 100 ميكرولتر 70٪ إيثانول لمدة 1 دقيقة ، وشفط الإيثانول ، ونقله إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد للتجانس. إذا تم قياس محتوى الحمض النووي في الأمعاء ، اشطفه لمدة دقيقة واحدة باستخدام هيبوكلوريت الصوديوم 0.6٪ قبل غسل الإيثانول.
2. قم بتخفيف الجانس ب 875 ميكرولتر مللي MRS ، ودوامة لمدة 5 ثوان ، وماصة 120 ميكرولتر من التجانس في البئر الأول من صفيحة ميكروتيتر.
3. قم بإجراء تخفيفين متسلسلين 1: 8 باستخدام 10 ميكرولتر متجانس و 70 ميكرولتر MRS في البئرين التاليين.
   1. قم بإزالة 10 ميكرولتر من البئر الأول وأضفه إلى البئر الثاني الذي يحتوي على 70 ميكرولتر MRS. اخلطي محتويات البئر الثاني جيدا ، وانقلي 10 ميكرولتر من البئر الثاني إلى البئر الثالث الذي يحتوي على 70 ميكرولتر MRS ، واخلطيهم جيدا. هذا يؤدي إلى 3 تركيزات إجمالية من 1,000 ميكرولتر الأصلي المتجانس: غير مخفف ، 1: 8 ، و 1: 64.
4. انقل 10 ميكرولتر من كل تخفيف إلى لوحة mMRS (باستخدام ماصة متعددة القنوات إذا رغبت في ذلك). قم بإمالة الطبق قليلا لنشر التخفيف عدة ملليمترات على سطح الأجار واترك السائل يجف قبل تحريك اللوحة. يجف السائل على الطبق بسرعة إذا كان عمر الألواح يومين ، مما يقلل من خلط قطرتين متجاورتين.
5. احتضن عند 30 درجة مئوية لمدة 1-2 أيام. قم بإزالة الألواح من الحاضنة بمجرد تمييزها ، وتكون المستعمرات الفردية مرئية ، وقم بالعد من التخفيف مع 10-100 مستعمرة معزولة.
6. احسب CFU لكل ذبابة باستخدام المعادلة E = C x D / P x V / F ، حيث E = CFU لكل ذبابة ، C = عدد المستعمرات التي تم عدها ، D = التخفيف ، P = μl مطلي ، V = حجم الذبابة المتجانسة ، و F = عدد الذباب المتجانس.

النتائج

ملف التعليمات البرمجية التكميلية: عينة من الحسابات. الرجاء النقر هنا لعرض هذا الملف (انقر بزر الماوس الأيمن للتنزيل).

المواد