A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Guan ، W. ، et al. تصور محاور الخلايا العصبية الحركية للساق ذبابة الفاكهة من خلال بشرة البالغين. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو طريقة لتشريح وإصلاح وتركيب الساق البالغة ذبابة الفاكهة مع الحفاظ على عضلاتها العصبية سليمة لتحليل التصوير.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Guan et al. ، تصور ذبابة الفاكهة محاور الخلايا العصبية الحركية للساق من خلال بشرة البالغين ، J. Vis. Exp.(2018).

1. تشريح الساق وتثبيتها

1. خذ صفيحة زجاجية متعددة الآبار واملأ العدد المناسب من الآبار بنسبة 70٪ من الإيثانول. أضف 15-20 ذبابا مخدرا بثاني أكسيد الكربون₂ (من أي جنسين وأي عمر) إلى كل بئر وباستخدام فرشاة ، امسح الذباب برفق في محلول الإيثانول حتى يغمر الذباب بالكامل.
   ملاحظة: هذه الخطوة هي إزالة الكراهية للماء من بشرة. لا تغسل لأكثر من 1 دقيقة ، لأن هذا يزيد من التألق التلقائي للبشرة.
2. اشطف الذباب 3 مرات بمحلول منظف خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 0.3٪ في محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS). احتفظ بالذباب في هذا المحلول لمدة 10 دقائق على الأقل.
   ملاحظة: يتم تثبيت الأرجل بشكل أفضل عند تضمين المنظفات ، مما قد يزيد من تغلغل المثبت داخل الساق.
3. ضع صفيحة متعددة الآبار على الجليد مع أنبوب من 4٪ بارافورمالدهايد (PFA).
   ملاحظة: يعد تحضير 4٪ PFA طازجا من محلول مخزون خال من الإيثانول بنسبة 16٪ من PFA أمرا بالغ الأهمية.
4. استخدم الملقط لإزالة رأس البطن من الذباب دون الإضرار بالجزء الصدري أو الساقين.
   ملاحظة: إزالة البطن تجعل من السهل إمساك الذبابة وتشريح الساقين.
5. قم بتشريح الأرجل من الجزء الصدري بالملقط وضع الأرجل في الآبار التي تحتوي على 4٪ PFA. لهذا ، ادفع برفق ولكن بقوة عند تقاطع coxa-thorax باستخدام طرف الملقط الناعم حتى تنفصل الساق.
6. ثبت الأرجل في 4٪ PFA طوال الليل عند 4 درجات مئوية (حوالي 20 ساعة إجمالا).
7. اغسل الأرجل بمحلول منظف خافض للتوتر السطحي غير أيوني بنسبة 0.3٪ في 1x PBS ، 5x لمدة 20 دقيقة لكل منهما.
8. استبدل عازلة الغسيل بوسيط تثبيت. احتفظ بالساق في وسط التثبيت لمدة يوم على الأقل قبل التركيب للسماح بتغلغلها الكامل في الساق.
   ملاحظة: إذا كان وسط التثبيت شديد اللزوجة ، فقم بتخفيف وسط التركيب إلى 80٪ باستخدام 1x PBS لأن التغيير المفاجئ في اللزوجة يمكن أن يتسبب في انهيار البشرة وإتلاف الهيكل العام للساق. اعتمادا على برنامج تشغيل Gal4 ، يمكن الحفاظ على الذباب لمدة 1 إلى 3 أسابيع عند 4 درجات مئوية في وسائط التركيب حتى التركيب.

فئة

2. تركيب الساق

1. ضع ما يقرب من 20 ميكرولتر من 70٪ من الجلسرين على الجانب الأيسر من شريحة المجهر وقم بتغطيتها بغطاء مربع مقاس 22 × 22 مم² (الشكل 1أ ، ب). الماصة حوالي 10 ميكرولتر من وسط التركيب على طول خط مواز للحافة اليمنى لهذا الغطاء وعلى مسافة صغيرة منه. أضف 30 ميكرولتر أخرى من وسيط التركيب على الجانب الأيمن من الشريحة (الشكل 1ج).
   ملاحظة: عند وضع غطاء على الساقين (انظر أدناه) ، سينتشر وسط التثبيت برفق تحت الغطاء وحول الساقين دون إزاحتهما.
2. باستخدام ملقط دقيق ، ارفع الساق من المحلول وضعها برفق على وسط التثبيت بالقرب من الغطاء الأيسر. افعل الشيء نفسه لكل ساق وقم بمحاذاة من أعلى إلى أسفل (الشكل 1د).
   1. ارفع الساقين وانقلهما في قطرة من الوسط بين طرفي الملقط. قم بتوجيه الساقين بطريقتين: الجانب الخارجي لأعلى أو لأسفل.
3. بمجرد محاذاة جميع الأرجل (يمكن تركيب ما يصل إلى 6-8 أرجل) بشكل صحيح ، ضع غطاء ثان على الساقين بحيث يستقر هذا الغطاء قليلا على الغطاء الموضوع مسبقا الشكل 1E للسماح بمسافة بين الغطاء والأنسجة ولمنع تلف الساقين (الشكل 1G).
   ملاحظة: بدلا من ذلك ، استخدم آبار الملصقات أو شمع تقويم الأسنان لإنشاء مسافة بين الغطاء والشريحة.
4. استخدم طلاء أظافر لتأمين موضع الأغطية في كل زاوية (الشكل 1F).
   ملاحظة: الأنسجة جاهزة الآن للتصوير.

Representative Results

Materials

Ethanol absolute	Fisher	E/6550DF/17	Absolute analytical reagent grade
nonionic surfactant detergent	Sigma-Aldrich	T8787	Triton X-100, for molecular biology
Fine forceps	Sigma-Aldrich	F6521	Jewelers forceps, Dumont No. 5
Glass multi-well plate	Electron Microscopy Sciences	71563-01	9 cavity Pyrex, 100 mm x 85 mm
PFA	Thermofisher	28908	Pierc 16% Formaldehyde (w/v), Methanol-free
Glycerol	Fisher BioReagents	BP 229-1	Glycerol (Molecular Biology)
Spacers	Sun Jin Lab Co	IS006	iSpacer, four wells, around 12 μL working volume per well, 7 mm diameter, 0.18 mm deep
Square 22 mm x 22 mm coverslips	Fisher Scientific	FIS#12-541-B	No. 1.5-0.16 to 0.19 mm thick
Mounting Medium	Vector Laboratories	H-1000	Vectashield Antifade Mounting Medium