مقالة منهجية

تحضير بويضات ذبابة الفاكهة الثابتة للتلوين المناعي: طريقة عالية الإنتاجية لإصلاح وإزالة الغشاء الخارجي

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Radford، S.J.، McKim، K. S. تقنيات لتصوير الطور الأولي والطور النقي للانقسام الاختزالي الأول في ذبابة الفاكهة الثابتة. J. Vis. Exp. (2016).

يمكن أن يكون التلوين المناعي لذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة أمرا صعبا بسبب الأغشية المحيطة بالبويضات. يصف هذا الفيديو طريقة عالية الإنتاجية للحصول على البويضات وتثبيتها وإزالة الأغشية للتلوين المناعي. يوضح البروتوكول المميز هذه التقنيات مع البويضات في المرحلة المتأخرة المستخدمة لتصور مراحل مختلفة من الانقسام الاختزالي.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول مقتبس من Radford and McKim ، تقنيات تصوير الطور الأولي والطور الطوري للانقسام الاختزالي الأول في ذبابة الفاكهة الثابتة البويضات ، J. Vis. Exp. (2016).

< strong class = "note" >ملاحظة: يتم تنفيذ الإجراءات في درجة حرارة الغرفة ما لم يذكر خلاف ذلك. تستخدم الحاضنات التي يتم التحكم في درجة حرارتها للحفاظ على درجات الحرارة لتربية الذباب والتهجين ما لم يذكر خلاف ذلك.

< p class = "jove_title" >1. الاستعدادات

  1. تحضير الذباب.
    1. مجموعات البويضات المخصبة ببروميتاطور.
      1. الذباب البالغ الصافي من المخزون الصحي أو الصغير أو عبر الثقافات. زجاجات العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية < / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بشكل عام ، ستكون زجاجتان صحيتان كافيتين ، على الرغم من أنه قد تكون هناك حاجة إلى المزيد لبعض الثقافات المتقاطعة.
      2. بعد يومين ، اجمع ~ 100 إلى 300 أنثى (تتراوح أعمارهن بين 0 إلى 2 أيام في هذه المرحلة) من الزجاجات. لا تحتاج الإناث إلى أن تكون عذارى. أضف القليل من معجون الخميرة إلى جانب القارورة وضع 30 أنثى و 10 إلى 15 ذكرا في كل من قوارير الخميرة. قوارير العمر لمدة يومين عند 25 درجة مئوية.
    2. مجموعات البويضات المخصبة بالطور.
      1. اجمع ~ 100 إلى 300 أنثى من المخزون أو عبر الثقافات. أضف القليل من معجون الخميرة إلى جانب القارورة وضع 30 أنثى لكل منها (بدون إضافة ذكور) في قوارير الخميرة. قوارير العمر لمدة ثلاثة إلى خمسة أيام عند 25 درجة مئوية.
  2. إعداد الحلول.
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تخزين المحاليل إلى أجل غير مسمى في درجة حرارة الغرفة ، ما لم يذكر خلاف ذلك.
    1. تحضير مخزن روب المعدل (5x): 500 ملي مولار HEPES ، 500 ملي سكروز ، 275 ملي أسيتات الصوديوم ، 200 ملي أسيتات البوتاسيوم ، 50 ملي جلوكوز ، 6 ملي كلوريد المغنيسيوم ، 5 ملي كلوريد الكالسيوم. استخدم 10 N 11: 8 هيدروكسيد الصوديوم: هيدروكسيد البوتاسيوم لرفع الرقم الهيدروجيني إلى 7.4. التعقيم عن طريق الترشيح. لا تعتيم. يحفظ في درجة حرارة -20 درجة مئوية ، قم بإذابة الثلج حسب الحاجة لتحضير ~ 200 مل من 1x Robb's لكل بويضة جاهزة.
    2. حلول التثبيت.
      1. الخيار # 1: تحضير تثبيت الفورمالديهايد / الهبتان. تحضير المخزن المؤقت للتثبيت: 1x محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) بالإضافة إلى 150 ملي من السكروز. للاستخدام ، اصنعه طازجا باستخدام 687.5 ميكرولتر من Fixation Buffer و 312.5 ميكرولتر 16٪ فورمالديهايد لكل بويضة جاهزة.
        أنذر: ارتد القفازات أثناء استخدام محاليل الفورمالديهايد في غطاء الدخان. التخلص من النفايات وفقا للإرشادات المؤسسية.
      2. الخيار # 2: تحضير تثبيت الفورمالديهايد / الكاكوديلات. تحضير مزيج الإصلاح: 250 ملي مولار سكروز ، 100 ملي أسيتات البوتاسيوم (درجة الحموضة 7.5) ، 25 ملي أسيتات الصوديوم (الرقم الهيدروجيني 7.0) ، و 25 ملي مولار EGTA (الرقم الهيدروجيني 8.0). للاستخدام ، اصنعها طازجا باستخدام 400 ميكرولتر من Fix Mix و 100 ميكرولتر من كاكوديلات البوتاسيوم (1 م ، درجة الحموضة 7.2) ، و 500 ميكرولتر 16٪ فورمالديهايد لكل بويضات جاهزة.
        أنذر: يحتوي كاكوديلات البوتاسيوم على الزرنيخ.
    3. تحضير PBS / Triton X-100: 1x PBS بالإضافة إلى 1٪ أو 0.05٪ Triton X-100. يحفظ في درجة حرارة 4 درجات مئوية.
    4. تحضير PBS-Tween 20-Bovine Serum Albumin (BSA) (PTB): 1x PBS و 0.5٪ BSA (وزن / حجم) و 0.1٪ Tween-20. يمكن تخزينه في درجة حرارة 4 درجات مئوية لمدة أسبوع واحد.

2. مجموعة من ذبابة الفاكهة في المرحلة المتأخرة

  1. نظرا لأن ذبابة الفاكهة البويضات ذات الأغشية السليمة ستلتصق بالبلاستيك والزجاج ، فقم بتغطية الجزء الداخلي من أنبوب واحد سعة 5 مل وماصة باستور واحدة لكل بويضة مع PTB.
  2. قم بتخدير جميع ~ 100 إلى 300 ذباب خميرة بثاني أكسيد الكربون وأضفه إلى الخلاط الذي يحتوي على ~ 100 مل 1x Robb's Buffer. نبض ثلاث مرات (~ 1 ثانية لكل منهما). احتفظ بالبويضات في Robb's لمدة <20 دقيقة لتجنب التنشيط.
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بدلا من ذلك ، يمكن تشريح البويضات يدويا من الإناث. ميزة هذه الطريقة هي أنها تتطلب عددا أقل من الإناث. ومع ذلك ، يجب توخي الحذر للحد من التعرض لثاني أكسيد الكربون إلى بضع دقائق فقط لتجنب القطع الأثرية المرتبطة بنقص الأكسجة.
  3. قم بالتصفية من خلال شبكة كبيرة (~ 1,500 ميكرومتر) إلى دورق سعة 250 مل لإزالة أجزاء الجسم الكبيرة. إذا بقيت العديد من البطون السليمة على شبكة ، فأعد طحن المواد باستخدام Robb's Buffer الإضافي ، ثم قم بالتصفية مرة أخرى. اتركيه يستقر ~ 2 دقيقة ، ثم نشفط من الطبقة العليا ، ويزيل أكبر عدد ممكن من أجزاء الجسم الكبيرة.
  4. قم بالتصفية من خلال شبكة صغيرة (~ 300 ميكرومتر) في دورق سعة 250 مل. اشطف البويضات المتبقية من الدورق الأول باستخدام روب إضافي وماصة باستور المطلية. دعنا يستقر ~ 3 دقائق ؛ سوف تستقر البويضات. استنشق الكل باستثناء ~ 10 مل.
  5. صب أكبر قدر ممكن من 10 مل في أنبوب مغلف سعة 5 مل. اتركيه يستقر ويزيل السائل وكرر العملية مع الباقي. اشطف البويضات المتبقية من الدورق باستخدام روب إضافي وماصة باستور المطلية. اتركه يستقر في أنبوب 5 مل لمدة ~ 3-5 دقائق.
< p class = "jove_title" >3. العلاجات الدوائية (اختياري)

  1. قم بتغطية أنبوب ثان سعة 5 مل ب PTB لكل تحضير للبويضة. أضف المذيب المناسب (التحكم) أو الدواء إلى 1 مل روب لكل تحضير للبويضة (الجدول 1).
  2. قسم البويضات إلى أنبوب 5 مل مطلي بالثاني. اتركيه يستقر ، ويزيل السائل ، ويضاف 1 مل من مذيب روب بالإضافة إلى أنبوب واحد و 1 مل من عقار روب بالإضافة إلى الأنبوب الثاني. نوتات لفترة زمنية مناسبة للعلاج من تعاطي المخدرات (الجدول 1). دعنا يستقر.
< p class = "jove_title" >4. التثبيت

  1. استنشق كل السوائل وأضف 1 مل على الفور.
  2. الخيار # 1: تثبيت الفورمالديهايد / الهبتان (التثبيت المخزن المؤقت بالإضافة إلى 5٪ الفورمالديهايد).
    1. إصلاح لمدة 2.5 دقيقة على المغذية. أضف 1 مل من السباع والدوامة 1 دقيقة. دعنا يستقر ~ 1 دقيقة.
    2. قم بإزالة كل السوائل ، ثم أضف 1 مل 1x PBS. دوامة 30 ثانية. دعنا يستقر ~ 1 دقيقة.
    3. قم بإزالة كل السوائل ، ثم املأ الأنبوب ب 1x PBS.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن استخدام البويضات على الفور أو الاحتفاظ بها على المغذي لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة.
  3. الخيار # 2: تثبيت الفورمالديهايد / الكاكوديلات (مزيج الإصلاح بالإضافة إلى 8٪ فورمالديهايد و 100 ملي مولار كاكوديلات).
    1. إصلاح لمدة 6 دقائق على المغذية. دعه يستقر 2 دقيقة. قم بإزالة السائل ، ثم املأ الأنبوب ب 1x PBS.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن استخدام البويضات على الفور أو الاحتفاظ بها على المغذي لعدة ساعات في درجة حرارة الغرفة.
< p class = "jove_title" >5. إزالة الأغشية ("المتداول")

  1. باستخدام ماصة باستور المطلية ، أضف ~ 500 إلى 1,000 بويضة إلى الجزء المتجمد (المغطى بالرمل) من شريحة زجاجية. قم بإزالة جميع أجزاء الجسم والمواد الدخيلة باستخدام الملقط. لا تدع البويضات تجف. أضف 1x PBS حسب الضرورة.
  2. ضع غطاء فوق البويضات و "لف" البويضات برفق حتى تتم إزالة جميع الأغشية (يؤدي سحب حافة الغطاء عبر البويضات بشكل أفضل). تحقق بشكل دوري من التقدم المحرز تحت المجهر ، مع إضافة المزيد من 1x PBS حسب الضرورة. توخي الحذر لأن الضغط المفرط سيدمر البويضات.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
دواء المذيبات تركيز المخزون التركيز النهائي وقت العلاج أثر الكولشيسين ايثانول 125 ملم 150 ميكرومتر 10 دقائق أو 30 دقيقة زعزعة استقرار غير حركية (10 دقائق) < BR / > أو جميع الأن...

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 16٪ فورمالديهايد تيد بيلا ، إنك. 18505 خطير؛ بمجرد فتحه، تخلص منه بعد شهر واحد 250 مل أكواب مختلف أنابيب 5 مل مختلف الخميرة الجافة النشطة مختلف تخلط بالماء لعمل عجينة قوام زبدة الفول السوداني ثنائي النواة 2 سيغما ب 1186 الخطره خلاط مختلف ألبومين مصل الأبقار سيغما أ 4161 كلوريد الكالسيوم مختلف الكولشيسين سيغما سي -9754 الخطره أغطية VWR 48366-227 رقم 1 1/2 DMSO مختلف EGTA مختلف ايثانول مختلف ملقط تيد بيلا ، إنك. 5622 ريال ملاقط دومون عالية الدقة الصف نمط 5 شرائح زجاجية VWR 48312-003 الجلوكوز مختلف هيبس VWR EM-5330 متاح من العديد من البائعين كلوريد المغنيسيوم مختلف شبكة كبيرة (~ 1,500 ميكرومتر) VWR AA43657-NK مجموعة متنوعة من التنسيقات والموردين الآخرين ، 12 أو 14 شبكة شبكة صغيرة (~ 300 ميكرومتر) مختبرات الطيف 146 424 مجموعة متنوعة من التنسيقات، على سبيل المثال، 146 422 أو 146 486 المغذي مختلف ماصات باستور مختلف أسيتات البوتاسيوم مختلف حمض الكاكوديليك سيغما سي 0125 DANGEROUSOUS؛ بدلا من ذلك، يمكن استبدال كاكوديلات الصوديوم هيدروكسيد البوتاسيوم مختلف أسيتات الصوديوم مختلف هيدروكسيد الصوديوم مختلف سكروز مختلف تاكسول (باكليتاكسل) سيغما تي 1912 الخطره تريتون X-100 صياد بي -28314 توين 20 صياد [بي-28320] دوار مختلف

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

مقالات ذات صلة