مقالة منهجية

الإزالة الميكانيكية لغشاء المشيمة والفيتيلين: طريقة لتحضير ذبابة الفاكهة للمراقبة المباشرة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Perkins، A. T. ، Bickel، S. E. باستخدام التهجين الموضعي الفلوري (FISH) لمراقبة حالة تماسك الذراع في الطور الأولي وذبابة الفاكهة الطورية الأولى. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو طريقة لإزالة أغشية المشيمة والفيتلين ميكانيكيا من بويضات ذبابة الفاكهة الناضجة المثبتة مسبقا. يظهر البروتوكول المميز عرضا توضيحيا مفصلا للإجراء الذي ينتج عنه بويضات متوافقة مع فحوصات التهجين الفلورية في الموقع.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول هو مقتطف من Perkins and Bickel ، باستخدام التهجين الفلوري في الموقع (FISH) لمراقبة حالة تماسك الذراع في الطور الأولي والطور الأول ذبابة الفاكهة البويضات ، J. Vis. Exp. (2017).

< p class = "jove_title" >1. إزالة المشيمات وأغشية Vitelline

< strong class = "note" >ملاحظة: انظر الشكل 1 للأدوات المطلوبة.

  1. بويضات منفصلة في المرحلة المتأخرة
    1. أضف 1 مل PBSBTx إلى طبق تشريح ضحل. استخدم P200 بطرف مطلي ب BSA لنقل المبايض الثابتة (في ~ 150 ميكرولتر) إلى الطبق الضحل. الماصة المبايض لأعلى ولأسفل مع طرف الماصة المطلي ب BSA لإخراج البويضات الناضجة من البويضات الأقل نضجا.
    2. عندما يتم فصل البويضات في المرحلة المتأخرة بشكل كاف ، انقل كل الأنسجة إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 500 ميكرولتر. قم بإزالة السائل الزائد باستخدام ماصة باستور مسحوبة ، مع ترك حوالي 150-200 ميكرولتر في الأنبوب. كرر القسم 1.1 للأنماط الجينية المتبقية.
  2. استعد للدرفلة
    1. بلل طبق بئر عميق مسبقا مع 200 ميكرولتر من PBSBTx. غطيه واتركيه جانبا. احصل على 3 شرائح زجاجية بلورية واترك الشريحة # 3 جانبا. افركي المناطق الزجاجية المصنفرة برفق من الشرائح # 1 و # 2 معا. اشطفها بالماء منزوع الأيونات لإزالة أي شظايا زجاجية وجففها بمنديل يمكن التخلص منه.
    2. قم بتغطية المناطق المتجمدة من الشرائح # 1 و # 2 باستخدام PBSBTx عن طريق إضافة 50 ميكرولتر من PBSBTx إلى شريحة واحدة وفرك هذه المنطقة بالشريحة الأخرى. قم بإزالة السائل بمنديل يمكن التخلص منه.
    3. ضع الشرائح تحت مجهر تشريح في التكوين الموضح في <فئة قوية = "xfig">الشكل 2أ. حافظ على اتصال المناطق المتجمدة من الشرائح # 1 و # 2 ، مع دعم الشريحة # 3 # 2.
  3. لف البويضات ؛ تأكد من أن اتجاه التدحرج دائما في خط مستقيم وليس حركة دائرية أبدا.
      قم
    1. بتبليل طرف ماصة P200 مسبقا في PBSBTx وقم بتفريق البويضات في أنبوب الطرد الدقيق عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل. انقل 50 ميكرولتر من السائل الذي يحتوي على البويضات إلى وسط الجزء الزجاجي المصنفر من الشريحة # 1. ارفع الشريحة # 2 للقيام بذلك.
    2. قم بخفض الشريحة # 2 ببطء حتى يخلق التوتر السطحي للسائل ختما بين منطقتي الزجاج المصنفر. يجب أن يكون هناك ما يكفي من السائل لتغطية المنطقة المتجمدة ولكن لا ينبغي أن يتسرب أي منها. إذا كان السائل يفيض، فاستخدم ماصة باستور مسحوبة لإزالة السوائل الزائدة.
    3. أمسك الشريحة السفلية (# 1) في مكانها بيد واحدة واستخدم اليد الأخرى لتحريك الشريحة العلوية (# 2) للخلف وللأمام في اتجاه أفقي ، مع الحفاظ على مستوى الشريحة # 2 ودعمها في الشريحة # 3. قم بالأداء تحت المجهر لسهولة تصور حركات البويضات وتقدمها.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستولد هذه الحركة احتكاكا وتتسبب في "تدحرج" البويضات وفقدان مشيمتها. يجب استخدام الحد الأدنى من الضغط ويجب أن تكون الحركات قصيرة وسريعة.
    4. بعد بضع حركات في الاتجاه الأفقي ، قم بتغيير زاوية الحركة قليلا (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب). بزيادات متعددة ، قم بزيادة هذه الزاوية تدريجيا إلى 90 درجة حتى تصبح حركة الشريحة العلوية (# 2) عمودية على اتجاه البداية (<الفئة القوية = "xfig">الشكل 2ب). لاحظ أن المشيمات الفارغة ستكون مرئية في السائل وأن البويضات التي تفتقر إلى المشيمات ستظهر أطول وأرق.
    5. كرر الخطوات 1.3.3 - 1.3.4 حوالي 7 - 10 مرات حتى يصبح المحلول غائما قليلا. توقف عن التدحرج عندما يبدو أن غالبية البويضات (75-85٪) قد فقدت أغشية vitelline.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: غالبا ما تكون النهاية المدببة المميزة مرئية على البويضات التي تفتقر إلى أغشية الزجاج. يصعب إزالة أغشية Vitelline أكثر من المشيمات. يمكن تطبيق ضغط خفيف على الشريحة العلوية (الشريحة # 2) أثناء التدحرج لتحقيق إزالة أغشية vitelline. غالبا ما تؤدي محاولة إزالة أغشية الزجاجية من جميع البويضات إلى تدمير البويضات الأخرى.
    6. ارفع الشريحة العلوية (# 2) برفق ، واسحب إحدى أركانها إلى وسط المنطقة المصقولة من الشريحة السفلية (# 1) بحيث تتراكم البويضات الملفوفة في وسط المنطقة المصقولة. اشطف البويضات من كلتا الشريحتين باستخدام PBSBTx في طبق البئر العميق الذي يحتوي على PBSBTx.
    7. نظف الشرائح # 1 و # 2 بالماء فائق النقاء ، وجففها بمنديل يمكن التخلص منه ، وأعد ضبطها. كرر الخطوات 1.3.1 - 1.3.6 حتى يتم دحرجة جميع البويضات من نفس النمط الجيني. يتطلب هذا عادة 3-4 جولات من التدحرج لكل نمط وراثي.
  4. إزالة الحطام بعد التدحرج
    1. أضف 1 مل PBSBTx إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. حرك السائل لتغطية جوانب الأنبوب.
    2. باستخدام طرف ماصة P1000 المطلي ب PBSBTx ، انقل البويضات المدرفلة من طبق البئر العميق إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على 1 مل من PBSBTx. أضف 2 مل إضافي من PBSBTx إلى الأنبوب المخروطي الذي يحتوي على البويضات.
    3. دع البويضات تبدأ في الاستقرار في الأسفل ، ثم قم بإزالة الجزء العلوي من 2 مل من المحلول الذي يحتوي على الحطام (المشيمات ، vitellines ، إلخ) باستخدام P1000 وتخلص منه. إذا لزم الأمر ، أمسك الأنبوب المخروطي على خلفية داكنة لرؤية البويضات غير الشفافة أثناء غرقها.
    4. أضف 2 مل إضافي من PBSBTx إلى البويضات ، وكرر الخطوة 1.4.3. كرر 1.4.3. لما مجموعه 3 جولات من إزالة الحطام.
    5. باستخدام طرف ماصة P1000 المطلي ب PBSBTx ، انقل البويضات مرة أخرى إلى أنبوب الطرد الدقيق الأصلي سعة 500 ميكرولتر. يجب أن تنتج 20-25 أنثى ما يقرب من 50 ميكرولتر من البويضات الناضجة المدرفلة.
  5. كرر القسم 4 للأنماط الجينية المتبقية باستخدام شرائح بلورية طازجة ، وطبق بئر عميق نظيف ، وأنبوب مخروطي جديد لكل نمط وراثي.
  6. إذا كان التخزين ضروريا ، انقل البويضات إلى 1x PBS مع 0.1٪ TritionX-100 وقم بتخزينها طوال الليل عند 4 درجات مئوية. لا ينصح بالتخزين طويل الأجل لأنه يمكن عكس تشابك الفورمالديهايد بواسطة المنظفات غير الأيونية.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: أدوات علم الخلايا. الأدوات المستخدمة في البروتوكول: (1) زوج من الملقط (# 5 دومون) ؛ (2) إبرة التنغستن. (3) طبق جيد عميق مع غطاء. (4) طبق تشريح الزجاج الضحل ؛ (5) ماصة باستور المسحوبة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ألبومين مصل الأبقار (BSA) فيشر ساينتيك بي بي 1600-100 تحضير 10٪ مخزون
تجميد الحصص 10٪ تريتون X-100 الترمو: العلمية هاتف 28314 Surfact-Amps PBSBTx 1X PBS ، 0.5٪ BSA ، 0.1٪ Trition X-100 ملقط دومونت # 5 إينوكس ، علم الأحياء 9 "ماصات باستور زجاجية يمكن التخلص منها صياد 13-678-20 ج الأوتوكلاف للتعقيم طبق تشريح الزجاج الضحل حسب الطلب طبق بئر عميق (3 آبار) بيركس 7223-34 إبرة التنغستن محلي الصنع شرائح زجاجية بلوري، 25 × 75 مم VWR العلمية هاتف: 48312-002 15 مل أنابيب مخروطية مختلف 500 ميكرولتر أنابيب ميكروفوج مختلف كيمويبس مختلف مناديل مبللة يمكن التخلص منها

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

PBSBTx

مقالات ذات صلة