اضطراب البشرة: طريقة لجمع الهيموليمف من ذبابة الفاكهة يرقات

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Reimels ، T. A. and Pfleger ، C. M. طرق فحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في ذبابة الفاكهة اليرقات. J. Vis. Exp. (2016).

ذبابة الفاكهة هيموليمف بمثابة دم وسوائل خلالي ، ينتشر في جميع أنحاء الجسم خلال مراحل اليرقة والبالغين. يصف هذا الفيديو بروتوكولا لجمع اليرقات من أجل تحديد الخلايا المنتشرة.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Reimels and Pfleger ، طرق فحص الغدة الليمفاوية والخلايا الدموية في ذبابة الفاكهة يرقات ، J. Vis. Exp.(2016).

< p class = "jove_title" >1. تركيز الخلايا الدموية المنتشرة

1. للحصول على يرقات من نفس مرحلة النمو تقريبا لهذا الفحص ، قم بتقييد جمع البيض عن طريق السماح للإناث بوضع البيض لفترة زمنية محددة من 2 إلى 6 ساعات.
2. اجمع اليرقات في تشريح آبار الأطباق المملوءة بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x (PBS).
3. لكل يرقة ، ضع 10 ميكرولتر 1x PBS في أنبوب طرد مركزي دقيق على الجليد و 10 ميكرولتر 1x PBS على وسادة تشريح نظيفة. ضع وسادة التشريح على قاعدة مجهرية مجسمة مضيئة.
4. جفف يرقة فردية عن طريق وضعها على منديل مناديل قبل نقلها إلى قطرة PBS على وسادة التشريح.
5. باستخدام زوج من الملقط ، قم بتمزيق البشرة برفق واقلبها بعناية لتحرير الهيموليمف.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: احرص على عدم كشط البشرة أو ضربها لأن ذلك قد يؤدي إلى إطلاق خلايا دموية لاطئة.
6. باستخدام ماصة ، اجمع الهيموليمف من وسادة التشريح. تجنب جمع بقايا اليرقات مثل الجسم الدهني.
7. أضف الهيموليمف إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق واخلطه عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن جمع عدة عينات في وقت واحد وحفظها على الجليد لمدة تصل إلى ساعة.
8. اختياري: امزج التريبان الأزرق مع عينة الهيموليمف في أجزاء متساوية لصبغ الخلايا الميتة واستبعادها. عد الخلايا في غضون 3 دقائق من إضافة Trypan blue لأنه سام للخلايا.
9. امزج العينة عن طريق سحب العينة لأعلى ولأسفل قبل تحميل 10 ميكرولتر في حجرة مقياس كثافة الدم.
10. إذا كنت تستخدم عداد خلايا آلي، فقم بتعيين المعلمات المناسبة لحجم الخلية ودائريتها. على سبيل المثال ، قم بتعيين حد أدنى لحجم الخلية يبلغ 2 ميكرومتر ، والحد الأقصى لحجم الخلية 22 ميكرومتر ، ودائرية من 75 إلى 80٪ استدارة للكشف عن الخلايا الدموية الطبيعية المستديرة. جرب معلمات مختلفة للكشف عن الخلايا الدموية الأكبر حجما على شكل مغزل ، مثل الصفائح الرقائقية. بدلا من ذلك ، استخدم مقياس كثافة الدم لحساب الخلايا الدموية يدويا.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أقراص PBS MP الطب الحيوي 2810305 تشريح الطبق كورنينج 7220-85 أنبوب الطرد المركزي الدقيق دينفيل سي 2170 وسادة تشريح سيليكون ، مصنوعة من مجموعة Sylgard 184 كرايدن (موزعة من خلال فيشر) NC9644388 (رقم كتالوج فيشر) مصنوع في طبق بتري عن طريق خلط مكونات مجموعة المطاط الصناعي سيلجارد وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. مجهر مجسمة Morrell Instruments (موزع نيكون) mna42000 ، MMA36300 طرازات نيكون SMZ1000 و SMZ645 مناديل الأنسجة VWR 82003-820 ملقط علوم المجهر الإلكتروني 72700-د.ز ماصة P200 إيبندورف 3120000054 عداد الخلايا الآلي للكونتيسة إنفيتروجين ج 10227 شرائح غرفة عد خلايا الكونتيسة إنفيتروجين سي 10283 مقياس الدم هوسر العلمية 3200 دق تربان بلو ستين تقنيات الحياة تي 10282