$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول هو مقتطف من DeAngelis and Johnson ، تشريح ذبابة الفاكهة العذراء شبكية العين للكيمياء المناعية ، والتحليل الغربي ، وعزل الحمض النووي الريبي ، J. Vis. Exp.(2019).
< p class = "jove_title" >1. تحضير الأنسجة
- قم بإعداد ذبابة الفاكهة (كما هو موضح سابقا في جرينسبان ، مطبعة مختبر كولد سبرينج هاربور ، (2004)) أو سلالات ذبابة الفاكهة الخاصة بالثقافة للحصول على شرانق من النمط الجيني المطلوب. لضمان ظهور عدد كبير من الشرانق بالصدفة ، قم بإنشاء مزارع الذباب هذه بشكل مكرر على وسائط غذائية غنية بالمغذيات أو وسائط غذائية قياسية مكملة بسخاء بمعجون الخميرة.
- الحفاظ على ثقافات ذبابة الفاكهة عند 25 درجة مئوية. بالنسبة للتهجين الذي يستخدم نظام UAS-GAL4 ، يعد GMR-GAL4 محركا مثاليا يتم التعبير عنه في خلايا قرص عين اليرقات الخلفية للثلم المورفوجيني وطوال تطور العذراء. يعمل UAS-lacZ X GMR-GAL4 المتقاطع كتقاطع تحكم مثالي لأنه يقود التعبير عن بروتين β-galactosidase غير الداخلي والخامل.
- استخدم طرف جبيرة الخيزران مقاس 6 بوصات مبللة بالماء المقطر لرفع الشرانق البيضاء برفق (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب) من جانب قوارير الثقافة الصحية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ) وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ج).
- ضع الأنابيب في صندوق طرف ماصة بلاستيكي مع قطعة صغيرة من الأنسجة مبللة بالماء المقطر للحفاظ على الغرفة في رطوبة كافية لحماية الشرانق من الجفاف (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1د). احتضان الشرانق عند 25 درجة مئوية حتى التشريح.
- استخدم جبيرة جافة من الخيزران مقاس 6 بوصات لدفع الشرانق برفق للخارج من أنبوب الطرد المركزي الدقيق إلى طبق تشريح أسود. ضع قطعة جديدة من الشريط اللاصق على الوجهين على طبق التشريح بعيدا عن الشرانق.
- باستخدام زوج من الملقط ، ضع الجانب الظهري للشرانق بعناية لأعلى (على سبيل المثال ، الطبقة المتجهة لأعلى ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب) على الشريط (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ). تأكد من أن الشرانق تلتصق جيدا بالشريط.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستمنع الرطوبة الموجودة على علبة العذراء الالتصاق الآمن بالشريط ، وفي هذه الحالة ، تسمح للشرانق بالجفاف في الهواء قبل وضعها على الشريط على الوجهين.
< p class = "jove_title" >2. تشريح مجمعات العين والدماغ
- استخدم الملقط لإزالة طبقة كل خادرة (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2ج).
- استخدم مقص التشريح المجهري لتقطيع أو قطع حالة العذراء لكل خادرة. افتح رفرف حالة العذراء للكشف عن الرأس والصدر والجزء الأمامي من البطن ، وقم بتأمين حواف حالة العذراء بالشريط على الوجهين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ج).
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ليس من الضروري الكشف عن الشرانق تماما.
- اخترق بطن كل خادرة بملقط حاد ، للإمساك بالحيوان ، وإزالته من علبة العذراء (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ج).
- ضع الشرانق على طبق التشريح الأسود ، بعيدا عن الشريط ، وقم بتغطيتها بحوالي 400 ميكرولتر من محلول الفوسفات المثلج البارد (PBS ، درجة الحموضة 7.4).
- أمسك كل خادرة من البطن بالملقط ، وباستخدام مقص التشريح الدقيق ، قم بعمل قطع مقطعي نظيف عبر الصدر بأكمله ، وقطع الخادرة إلى نصفين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2د).
- قم بإزالة البقايا الخلفية لكل جثة من PBS وضعها على جانب واحد على طبق التشريح (لا تتخلص منها ، انظر الخطوة 3.2.1).
- باستخدام زوجين من الملقط الدقيق ، افتح الصدر ورأس كل خادرة للكشف عن مركب العين والدماغ (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2ه). للقيام بذلك ، أمسك الحواف المقطوعة لظهارة الصدر وقم بتمزيقها تدريجيا لفتح كبسولة الصدر ثم الرأس ، مما يؤدي إلى تعريض مركب العين والدماغ والأنسجة الدهنية المحيطة.
- دون الإمساك بالأنسجة ، استخدم الملقط لتوجيه مركب العين والدماغ بعيدا عن بقايا كبسولة الرأس أو اغرف مركب العين والدماغ من كبسولة الرأس الممزقة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: مركب العين والدماغ على شكل دمبل ، أبيض فاتح ، وأكثر شفافية من الدهون المحيطة بلون الكريم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2ب ، ه).
- باستخدام الملقط ، قم بإزالة معظم الدهون المرتبطة بمجمعات العين والدماغ بعناية دون لمس أنسجة العين.
فئة
3. معالجة الأنسجة للتألق المناعي
- قم بتشريح ما لا يقل عن 6-10 شرانق كما هو موضح (الخطوات 2.1-2.9).
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تميل ثلاث إلى أربع نسخ مكررة مستقلة لكل تشريح إلى إنتاج بيانات كافية لاختبار الفرضية.
- الغسيل والتثبيت
- قم بقص طرف طرف الماصة P20 أو P100 بشفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتحة الطرف إلى ~ 1 مم في نصف قطرها وتشحيمها عن طريق سحب مزيج من PBS والدهون لأعلى ولأسفل. يمكن الحصول على هذه الدهون من بقايا الذبيحة التي تمت إزالتها في الخطوة 2.6.
- انقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBS في طبق زجاجي مكون من 9 آبار ، على الثلج. استخدم الطرف المشحم والماصة الدقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 لنقلها.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تلتصق مجمعات العين والدماغ بأطراف غير مشحمة أثناء سحب العين وتتلف أو تضيع.
- قم بإزالة الدهون المتبقية المرتبطة بأنسجة العين عن طريق سحب PBS لأعلى ولأسفل لتحريك مجمعات العين والدماغ برفق. في هذه الخطوات وجميع خطوات الغسيل اللاحقة ، لا تقم بسحب ماصة مجمعات العين والدماغ مباشرة لأعلى ولأسفل لأن ذلك سيتلف أنسجة العين الهشة.
- انقل مجمعات العين والدماغ بحجم بسيط (<20 ميكرولتر) من PBS إلى 250 ميكرولتر على الأقل من المثبتات. امزج عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 35 دقيقة ، على الجليد.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن استخدام نفس الطرف المشحم المحضر في الخطوة 3.1.1 لهذا النقل.
- باستخدام نفس طرف الماصة ، انقل مجمعات العين والدماغ إلى بئر يحتوي على ~ 400 ميكرولتر من PBS. امزج عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل واحتضانه لمدة 5-10 دقائق على الثلج لغسله. كرر خطوة الغسيل مرتين على الأقل.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن الحفاظ على مجمعات العين والدماغ لعدة ساعات في غسل PBS النهائي ، أو على الجليد ، أو عند 4 درجات مئوية ، قبل الانتقال إلى الخطوة 3.3.1.
- تلطيخ الأجسام المضادة
- لمنع الأنسجة قبل التعرض لمحاليل الأجسام المضادة ، انقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT. استخدم الطرف المشحم والماصة الدقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 للنقل. احتضن لمدة 10 إلى 60 دقيقة ، على الجليد.
- تحضير محلول الأجسام المضادة الأولية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة المناسبة في PBT. نظرا لأن مجمعات العين والدماغ يتم تحضينها في 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة ، فإن الحجم المحضر سيكون تكرارا مكررا ل 10.
- Aliquot 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة في بئر نظيف من صينية ميكروويل 72 بئر.
- قم بقص طرف طرف الماصة P10 بشفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتحة الطرف إلى ~0.5 مم في نصف قطرها وتشحيمها عن طريق سحب PBT لأعلى ولأسفل.
- لا تنقل أكثر من 5 مجمعات للعين والدماغ ، بحجم <3 ميكرولتر من PBS ، إلى كل بئر سعة 10 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة باستخدام ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P10 وطرف مشحم.
- قم بتجانس محلول الجسم المضاد عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. لا تقم بسحب مجمعات العين والدماغ لأعلى ولأسفل لأن ذلك سيؤدي إلى تلف الأنسجة.
- لتقليل تبخر محلول الجسم المضاد ، ضع قطعة صغيرة من الأنسجة مبللة بالماء المقطر في صينية الميكروبئر وأغلق الدرج (على سبيل المثال ، مع توفير الغطاء). احتضان طوال الليل عند 4 درجات مئوية.
- انقل مجمعات العين والدماغ من صينية microwell إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي مكون من 9 آبار ، لغسلها. استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P10 وطرف مشحم ب PBT (قم بالتحضير كما هو موضح في الخطوة 3.3.4). امزج عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 5-10 دقائق على الثلج.
- كرر خطوة الغسيل مرتين على الأقل. استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 وطرف مشحم PBT لنقل مجمعات العين والدماغ بين محاليل الغسيل.
- تحضير محلول الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيف الأجسام المضادة الثانوية المناسبة التي تحمل علامة الفلوروفور في PBT كما هو مطلوب. 100 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الثانوية كافية لكل دفعة من 6-10 شرانق. Aliquot محلول الجسم المضاد الثانوي في طبق تشريح زجاجي مكون من 9 آبار.
- نقل مجمعات العين والدماغ إلى محلول الأجسام المضادة الثانوية. استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 وطرف مشحم PBT للنقل.
- احتضان مجمعات العين والدماغ في محلول الأجسام المضادة الثانوية لمدة 1-2 ساعة في درجة حرارة الغرفة ، أو 3-5 ساعات عند 4 درجات مئوية. لمنع تبييض الفلوروفورات بالضوء ، قم بتغطية المستحضر بورق الألمنيوم.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قد تختلف المدة المثلى للحضانة في محلول الأجسام المضادة الثانوية وفقا للأجسام المضادة الأولية والثانوية المستخدمة.
- انقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي مكون من 9 آبار لغسلها. امزج عن طريق سحب المحلول لأعلى ولأسفل. احتضن لمدة 5-10 دقائق على الثلج. يجب تكرار خطوة الغسيل هذه مرتين على الأقل.
- التثبيت الثانوي
- للتثبيت الثانوي ، انقل مجمعات العين والدماغ إلى 200 ميكرولتر على الأقل من المثبت وحتضنها لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة أو 35 دقيقة عند 4 درجات مئوية
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يؤدي التثبيت الثانوي إلى تصلب أنسجة العين ، مما يساعد على التركيب (الخطوة 3.5).
- استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 وطرف مشحم PBT لنقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBT في طبق زجاجي مكون من 9 آبار ، على الثلج ، لغسله لمدة 5 دقائق.
- كرر خطوة الغسيل مرة واحدة على الأقل.
- استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 وطرف مشحم PBT لنقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 400 ميكرولتر من PBS في طبق زجاجي مكون من 9 آبار ، على الثلج ، لشطفه لمدة 1-2 دقيقة. حافظ على حركة الأنسجة عن طريق سحب PBS ، ولكن ليس الأنسجة ، لأعلى ولأسفل لمنع مجمعات العين والدماغ من الاستقرار والالتصاق بالطبق الزجاجي أثناء شطف PBS.
- تصاعد
- انقل مجمعات العين والدماغ إلى ~ 200 ميكرولتر من وسائط التصاعد. استخدم ماصة دقيقة لإزاحة الهواء P20 أو P100 وطرف مشحم PBT لنقل مجمعات العين والدماغ. اسمح للأنسجة بالتوازن في وسائط التركيب لمدة 1-2 ساعة.
- ضع قطرة 5-8 ميكرولتر من وسائط التثبيت الجديدة على شريحة مجهر نظيفة.
- قم بقص طرف P10 بشفرة حلاقة نظيفة لزيادة فتحة الطرف إلى ~ 0.5 مم في نصف قطرها واستخدم هذا والماصة الدقيقة لإزاحة الهواء P10 لنقل مجمعات العين والدماغ في 5-8 ميكرولتر من وسائط التركيب إلى قطرة وسائط التثبيت على الشريحة.
- استخدم إبرتين من التنغستن لفصل العينين عن الفصوص البصرية. قم بتثبيت مركب العين والدماغ على الشريحة بإبرة تنجستن متينة وقم بتقطيع كل عين بعيدا عن الفص البصري المرتبط بها بإبرة تنجستن دقيقة (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2F).
- استخدم إبرة التنغستن الدقيقة لمناورة كل عين على سطح شريحة المجهر مع السطح القاعدي لكل عين مجاور للشريحة. قم بخفض غطاء نظيف برفق على المنديل وقم بتثبيته بطلاء الأظافر.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: سيؤدي ترتيب العيون على الشريحة بحيث تكون قريبة من بعضها البعض أو في خط إلى تسهيل الفحص المجهري اللاحق.
- صور شبكية العين باستخدام الفحص المجهري الفلوري أو متحد البؤر.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب تخزين الشرائح عند 4 درجات مئوية إذا لم يتم تصويرها على الفور.
