ذبابة الفاكهة تشريح عضلات الطيران غير المباشر للخادرة المتأخرة (IFM): طريقة لجمع الأنسجة عالية الإنتاجية

الملخص

المصدر: Kao، S. Y.، et al. تشريح ذبابة الفاكهة السوداء عضلات الطيران لنهج Omics. J. Vis. Exp. (2019).

تستخدم عضلات الطيران ذبابة الفاكهة كنظام نموذجي لتنمية العضلات وعلم وظائف الأعضاء. يصف هذا الفيديو عضلات الطيران للبالغين ويسلط الضوء على بروتوكول لتشريح عضلات الطيران غير المباشرة النامية المناسبة لتسلسل الحمض النووي الريبي من الشرانق.

البروتوكول

< p class = "jove_content">هذا البروتوكول هو مقتطف من Kao et al. ، تشريح ذبابة الفاكهة السوداء عضلات الطيران لنهج Omics، J. Vis. Exp. (2019).

< p class = "jove_title" >1. تشريح IFM بعد 48 ساعة APF

1. قم بتجميع المعدات اللازمة بما في ذلك ملقطين من الدرجة البيولوجية # 5 ، ومقص دقيق ، وشرائح مجهر زجاجي قياسية ، وشريط مزدوج العصا ، وماصة ، وأطراف ماصة ، وجليد جاف ، وكاشف عزل (لتطبيقات الحمض النووي الريبي) (انظر جدول المواد). قم بتبريد أنابيب 1x PBS وأجهزة الطرد المركزي الدقيقة على الجليد.
2. باستخدام فرشاة رسم مبللة قليلا ، انقل الشرانق المرحلية إلى شريط من الشريط اللاصق على الوجهين مركب على شريحة مجهرية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ). ضع الشرانق في خط ، موجه في نفس الاتجاه (البطني لأسفل والأمامي باتجاه أسفل الشريحة).
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: احرص على عدم استخدام الكثير من الماء على فرشاة الرسم أو الفلتر ، وإلا فلن تلتصق الشرانق جيدا. إذا لم تلتصق الشرانق ، جفها أولا عن طريق نقلها أولا إلى مرشح جاف أو مناديل ورقية. قم بتركيب أكبر عدد ممكن من الشرانق التي يمكن تشريحها خلال نافذة زمنية مدتها 30 دقيقة ، من الناحية المثالية ~ 10 شرانق.
3. قم بإزالة الخادرة من علبة العذراء. استخدم الملقط لفصل وفتح حالة العذراء فوق الفتحات التنفسية الأمامية (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1ب).
4. حرك زوجا من الملقط برفق ظهريا باتجاه الخلف ، مع قطع حالة العذراء أثناء تحرك الملقط (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب'). احرص على عدم تمزق الخادرة الأساسية. حرر الخادرة من العلبة المفتوحة وانقلها على الفور إلى قطرة 1x PBS على شريحة مجهر ثانية (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب" ، ج).
5. كرر الخطوتين 1.3 و 1.4 لجميع الشرانق في السطر ، ثم ضع شريحة الشريط المزدوج جانبا.
6. باستخدام المقص الناعم ، اقطع بطن الخادرة بعيدا عن الصدر وادفعه إلى كومة منفصلة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1D ، D'). كرر مع الشرانق المتبقية.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ابدأ في توقيت طول التشريح بالخطوة 1.6 ، بمجرد تعطيل سلامة العذراء. قم بتشريح أكبر عدد ممكن من الذباب في 20-30 دقيقة لمنع موت الخلايا والتغيرات النسخية والبروتينية المرتبطة بها. عند تشريح 1 د بالغين أو >90 ساعة من الشرانق ، غالبا ما يكون من المناسب للخطوات اللاحقة إزالة الرأس بشكل إضافي باستخدام المقص الناعم.
7. باستخدام المناديل الورقية ، قم بإزالة غالبية 1x PBS (غائم بشكل عام مع الدهون العالقة) بالإضافة إلى كومة البطن (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ه). أضف قطرة من 1x PBS الطازج والمبرد إلى الصدر المتبقي.
8. استخدم المقص لقطع الصدر إلى نصفين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1F ، F') عن طريق القطع من الرأس إلى أسفل محور الجسم الطولي بحركة واحدة. بالتناوب ، إذا تمت إزالة الرأس ، فقم أولا بإدخال المقص حيث تم توصيل الرأس وقطع النصف العلوي من الصدر طوليا بين IFMs. ثم قم بقص الجانب البطني من الصدر بقطع ثان في نفس الاتجاه.
9. كرر الخطوتين 1.7 و 1.8 لتشريح جميع الشرانق ، مما يؤدي إلى تكوين كومة من أنصاف الصدر بالقرب من مركز الشريحة. تأكد من وجود ما يكفي من 1x PBS المبرد على الشريحة حتى لا تجف المقاطع النصفية.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بعد 48 ساعة APF ، تكون IFMs كبيرة بما يكفي لتكون مرئية تحت مجهر تشريح قياسي للعين المدربة. في هذه المرحلة من البروتوكول ، يمكن نقل العضلات التي تحمل علامة الفلورسنت إلى نطاق تشريح الفلورسنت للمساعدة في تحديد IFM أو لأغراض التدريب ، لكن هذا ليس ضروريا.
10. تشريح IFMs من الصدر. اعزل أحد الأجزاء النصفية باستخدام ملقط # 5 (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1G ، H). أدخل أطراف ملقط واحد برفق أعلى وأسفل منتصف IFMs (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1G'، H'). أثناء تثبيت الملقط الأول ، استخدم مقصا دقيقا لقطع أحد طرفي IFM بعيدا عن البشرة والأوتار. بعد ذلك ، قم بقص الطرف الآخر من IFM من البشرة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1G '' ، H '').
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: اعتمادا على اتجاه الصدر بعد قطع IFM الأول ، من المفيد تدوير الصدر 180 درجة بحيث يكون القطع الثاني IFM أسهل في الأداء.
11. قم بإزالة حزمة IFM من الصدر باستخدام ملقط (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1G''' ، H '') ، ونقلها إلى حافة فقاعة PBS لاستخدام شد الماء لتثبيتها في مكانها (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1I). ادفع الذبيحة إلى الجانب الآخر من الشريحة. كرر مع أنصاف الصدر المتبقية ، مما يؤدي إلى إنشاء مجموعة من IFMs التي تم تشريحها.
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا لم تبقى IFMs في كومة أنيقة ، فقم بإزالة بعض 1x PBS بمنديل. احرص على عدم ترك كل PBS يتبخر ، وتأكد من أن IFMs و hemithoraxs التي تم تشريحها تظل مغطاة بالمخزن المؤقت.
12. بعد تشريح جميع IFMs ، قم بإجراء مراقبة الجودة بسرعة على العضلات المقطعة. باستخدام ملقط # 5 ، قم بإزالة أي عضلة قفزة أو شظايا بشرة ربما تكون قد وجدت طريقها إلى العينة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1J-K ').
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: تبدو عضلة القفز مختلفة عن IFM. في حالة تشريح Mef2-Gal4 المسمى العضلات تحت التألق ، فإن عضلة القفز لها مضان أضعف وشكل وملمس مختلفين. تحت الضوء العادي ، يبدو شبه شفاف بينما تكون IFMs صفراء حليبية معتمة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1J-J "، K).
13. باستخدام توتر الماء ، التقط (ولكن لا تسحق) IFMs التي تم تشريحها بين زوج من الملقط (<فئة قوية = "xfig">الشكل 1لتر). انقل IFMs إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل مملوء مسبقا ب 250 ميكرولتر من 1x PBS المبرد (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1م). تابع على الفور القسم 2.
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: عندما يتم إحضار أطراف الملقط بالقرب من بعضها البعض ورفعها من محلول عازل ، يتسبب توتر الماء في التقاط فقاعة عازلة بين أطراف الملقط. إذا كانت IFMs موجودة أيضا في هذه الفقاعة ، فيمكن رفعها من المحلول ونقلها بسهولة إلى وعاء آخر مملوء بالعازلة. من المهم الضغط على الملقط لتقريب الأطراف من بعضها البعض دون لمس بعضها البعض ، لتجنب نقع الأنسجة التي تم التقاطها في الفقاعة العازلة.

2. بيليه والحفاظ على عينة IFM

قم بتكسير IFMs عن طريق الطرد المركزي لأنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل لمدة 3-5 دقائق عند 2,000 × جم في جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2 أ ، ب).
2. قم بإزالة المخزن المؤقت باستخدام طرف ماصة (<الفئة القوية = "xfig">الشكل 2ج).
3. بالنسبة لتطبيقات الحمض النووي الريبي ، أعد تعليق حبيبات IFM في 50-100 ميكرولتر من المخزن المؤقت لعزل الحمض النووي الريبي المطلوب (انظر جدول المواد ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2د). وإلا، انتقل إلى الخطوة 2.4.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تجميد IFMs جافا بعد الخطوة 2.2 لمستحضرات قياس الطيف الكتلي أو عزل الحمض النووي الريبي بمجموعات تجارية (انظر النتائج التمثيلية). بالنسبة لتطبيقات الحمض النووي الريبي ، يتم الحصول على نتائج أفضل عن طريق إعادة تعليق وتجميد حبيبات IFM على الفور في المخزن المؤقت للعزل.
4. قم بتجميد العينة على الثلج الجاف أو التجميد المفاجئ في النيتروجين السائل (<فئة قوية = "xfig">الشكل 2ه). يحفظ في درجة حرارة -80 درجة مئوية حتى يصبح جاهزا للخطوات اللاحقة في تحضير العينة لتحليلها في اتجاه مجرى النهر.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بعد الحفظ بالتبريد ، يمكن تخزين العينات لعدة أشهر قبل معالجتها للتحقيق في المصب.

النتائج

الشكل 1: تشريح IFMs بعد 48 ساعة APF. (أ) محاذاة الشرانق على شريط مزدوج العصا. (ب) إزالة الشرانق من حالة العذراء عن طريق الفتح الأمامي ، وقطع العلبة ظهريا (B') ، ورفع الخادرة (B''). تمثل رموز الدائرة نفس الشكل 2. (ج) نقل الشرانق إلى العازلة. (د) إزالة البطن بالمقص (الأسهم المزدوجة الصفراء) والفصل عن الصدر ...

المواد

<جدول fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="دائما"> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات أطباق ثقافة 60 مم سيجما ألدريتش Z643084-600 إيه أطباق Greiner ، 60 مم × 15 مم ، مهواة كاميرا الهاتف الخليوي ، Samsung Galaxy S9 سامسونج SM-G960F / DS تستخدم للصور التي لم يتم التقاطها تحت المجهر شريط لاصق مزدوج سكوتش / 3 م معرف 3M 70005108587 شريط على الوجهين، متوفر في معظم معالجات المستلزمات المكتبية دومون # 5 ملقط أدوات العلوم الدقيقة 11252-20 ملقط Inox مستقيم 11 سم ، درجة علم الأحياء بطرف 0.05 مم × 0.02 مم كاميرا مجهر تشريح الفلورسنت ، كاميرا Leica DFC310 FX لايكا www.leica-microsystems.com برنامج مجهر تشريح الفلورسنت ، مجموعة تطبيقات Leica (LAS) الإصدار 4.0.0 لايكا www.leica-microsystems.com مجهر تشريح الفلورسنت ، Leica M165 FC لايكا www.leica-microsystems.com يطير: Bru1 [M2] ذبابة الأسهم. هذه الورقة يطير: Bru1 [M3] ذبابة الأسهم. هذه الورقة يطير: Mef2-GAL4 مركز بلومنجتون للأوراق المالية BDSC: 27390 طيب الأسهم ذبابة: سلم[1] مركز بلومنجتون للأوراق المالية 3274 طيب الأسهم يطير: salm[FRT] ذبابة الأسهم. انظر Spletter et al.، Elife، 2018 يطير: UAS-Bru1IR مركز فيينا لأبحاث ذبابة الفاكهة GD41568 مخزون الذبابة ، دبوس شعر RNAi يطير: UAS-GFP :: Gma مركز بلومنجتون للأوراق المالية BDSC: 31776 طيب الأسهم يطير: UAS-mCD8a :: GFP مركز بلومنجتون للأوراق المالية BDSC: 5130 طيب الأسهم يطير: ث [1118] مركز بلومنجتون للأوراق المالية 3605 طيب الأسهم يطير: weeP26 ذبابة الأسهم؛ انظر كلاين وآخرون، علم الوراثة، 2003 كاشف الكشف عن GFP ، GFP-Booster جهاز ChromoTek جي بي إيه 488-100 الجليكوجين إنفيتروجين هاتف: 10814-010 برنامج معالجة الصور ، Photoshop CS6 طُوب www.adobe.com إيزوبوبانول سيجما ألدريتش I9516-25ML 2-بروبانول الطريقة 1 (عزل الحمض النووي الريبي): TRIzol تقنيات الحياة 15596018 Guanidinium isothiocyanate ومحلول أحادي الطور الفينول الطريقة 2 (عزل الحمض النووي الريبي): الطريقة 1 + مجموعة TURBO الخالية من الحمض النووي إنفيتروجين AM1907 عزل TRIzol متبوعا بالعلاج بمجموعة لإزالة الحمض النووي الطريقة 3 (عزل الحمض النووي الريبي): مجموعة Direct-zol RNA Miniprep Plus Kit زيمو للأبحاث R2070S عزل الحمض النووي الريبي في TRIzol ، ولكن عبر الأعمدة التجارية بدلا من استخدام فصل الطور.
علاج DNase الموصى به الذي تم إجراؤه باستخدام Monarch Dnase I في Monarch DNase I Reaction buffer. الطريقة 4 (عزل الحمض النووي الريبي): مجموعة RNeasy Plus الصغيرة كياجين 74134 استخدمنا علاج DNase المقدم. تم تجانس كريات IFM في مخزن RTL كما هو مقترح للأنسجة الحيوانية. الطريقة 5 (عزل الحمض النووي الريبي): نظام ReliaPrep للأنسجة المصغرة للأنسجة الحمض النووي الريبي بروميجا الطراز Z6110 طبقنا بروتوكول "تنقية الحمض النووي الريبي من الأنسجة الليفية". الطريقة 6 (عزل الحمض النووي الريبي): مجموعة Monarch Total RNA Miniprep Kit نيو إنجلاند بيولابيس تي 2010 جي طبقنا البروتوكول على الأنسجة / الكريات البيض وقمنا بتحلل 300 ميكرولتر من كاشف حماية الحمض النووي الريبي. أنابيب الطرد المركزي الدقيقة ثيرمو فيشر AM12400 أنابيب ميكروفوج خالية من RNase ، 1.5 مل شرائح المجهر ثيرمو فيشر 12342108 شرائح قياسية، غير مشحونة، 1 مم الرسام مارابو 1910000000 Marabu Fino Round No. 0 ، أو فرشاة مماثلة من أي مصدر فني بارافورمالدهيد سيجما ألدريتش 158127 المخزن المؤقت PBS (1x) سيجما ألدريتش ص 4417 أقراص ملحية مخزنة بالفوسفات لمحاليل 1 لتر ، درجة الحموضة 7.4 PFA PureTip نصائح الماصة علمي عنصري ES-7000-0101 بديل اختياري لأطراف الماصة القياسية لتقليل فقد العينة؛ فتحة 100 مل، 0.8 مم أطراف الماصة سيجما ألدريتش ص 5161 أطراف ماصة عالمية سعة 200 مل تركيز الحمض النووي الريبي النهج 1 وآثار سلامة الحمض النووي الريبي ، المحلل الحيوي تقنيات Agilent G2939BA نهج تركيز الحمض النووي الريبي 2 ، Nanodrop ثيرمو فيشر إن دي-2000 نهج تركيز الحمض النووي الريبي 3 ، كيوبت 4 فلورومتر إنفيتروجين س 33238 RNase A بروميجا أ7937 ماء خال من RNase ، ثنائي إيثيل بيروكربونات (DEPC) سيجما ألدريتش د5758 يعالج DEPC الماء طوال الليل ثم الأوتوكلاف ، لإزالة كل RNase. RT Kit # 1: Super Script III Reverse Transcriptase Kit إنفيتروجين 18080-044 طقم النسخ العكسي RT Kit # 2: LunaScript نيو إنجلاند بيولابيس E3010S طقم النسخ العكسي RT Kit # 3: مجموعة النسخ العكسي QuantiNova كياجين هاتف: 205410 طقم النسخ العكسي البرنامج الإحصائي: GraphPad Prism منشور GraphPad www.graphpad.com البرنامج الإحصائي: Microscoft Excel مايكروسوفت تم شراؤها كجزء من الحزمة: Office Home & Student 2019 جهاز طرد مركزي على سطح الطاولة إيبندورف 5405000760 جهاز طرد مركزي Eppendorf 5425 أو ما يعادله المناديل / الكيمويبس سيجما ألدريتش Z188956 مناديل مناديل قياسية نقل الماصة سيجما ألدريتش Z350796 ماصة بلاستيكية مقص زنبركي فاناس أدوات العلوم الدقيقة 15000-00 حافة القطع 3 مم ، قطر الطرف 0.05 مم ، الطول 8 سم ورقة واتمان سيجما ألدريتش 1004-070 دوائر ورق الترشيح، الدرجة 4، 70 مم