ذبابة الفاكهة في الجسم الحي تصوير الكالسيوم: طريقة للتصوير الوظيفي للنشاط العصبي

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Hancock، CE، et al. In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning Synaptic Plasticity in ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو تصوير الكالسيوم في الجسم الحي في الخلايا العصبية ذبابة الفاكهة باستخدام GCaMP. يوضح مقطع البروتوكول المميز كيفية تسجيل التغييرات في مضان GCaMP من الخلايا العصبية لجسم الفطر أثناء تجربة تكييف حاسة الشم.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول هو مقتطف من Hancock et al. ، In Vivo Optical Calcium Imaging of Learning Synaptic Plasticity in ذبابة الفاكهة السوداء ، J. Vis. Exp.(2019).

فئة

1. تصوير الكالسيوم في الجسم الحي

استخدم مجهرا متعدد الفوتون مزودا بليزر الأشعة تحت الحمراء وهدف الغمر في الماء (انظر جدول المواد) ، مثبت على طاولة معزولة بالاهتزاز. لتصور مؤشرات الكالسيوم المستندة إلى GFP ، قم بضبط الليزر على طول موجي للإثارة يبلغ 920 نانومتر وقم بتثبيت مرشح تمرير النطاق GFP.
باستخدام مقبض الضبط Z الخشن ، امسح المحور Z للدماغ وحدد موقع منطقة الدماغ التي تهمك. استخدم وظيفة الاقتصاص لتركيز المسح الضوئي على هذه المنطقة فقط لتقليل وقت المسح الضوئي، ولتدوير عرض المسح الضوئي بحيث يكون الجزء الأمامي من الرأس متجها لأسفل.
اضبط حجم الإطار على 512 × 512 بكسل ، وسرعة المسح الضوئي إلى > 4 هرتز ، ومسح المنطقة (في البعد Y) بحيث يتم تغطية الخلايا العصبية ذات الأهمية.

< p class = "jove_title" >2. تصور عابرات الكالسيوم التي تثيرها الرائحة من خلال التكييف الشمي

استخدم نظام توصيل الرائحة الذي يمكنه توصيل العديد من محفزات الرائحة بطريقة دقيقة مؤقتا.
1. استخدم جهاز كمبيوتر إضافيا للتحكم في الجهاز ، وللتواصل مع برنامج مجهر التصوير لتنسيق تحفيز الرائحة مع التقاط الصور أثناء التجارب.
2. بدء حزمة ماكرو مبرمجة مسبقا قادرة على ربط برنامج الحصول على الصور وبرنامج توصيل الرائحة (على سبيل المثال ، حزمة ماكرو VBA مثبتة في برنامج التحكم في المجهر ، انظر جدول المواد) التي تستجيب لمشغل إدخال خارجي يتم توفيره عن طريق بدء بروتوكول توصيل الرائحة في برنامج منفصل).
ابدأ القياس بمراقبة عابرات الكالسيوم "قبل التدريب" / الساذجة التي تثيرها الرائحة بدقة 512 × 512 بكسل ومعدل إطارات يبلغ 4 هرتز. قم بتوصيل محفز رائحة 2.5 ثانية محاط بالحصول على صورة إضافية لمدة 6.25 ثانية قبل بداية الرائحة (لإنشاء قيمة خط الأساس F₀) و 12.5 ثانية بعد إزاحة الرائحة. كرر هذا مع رائحة ثانية ثم برائحة ثالثة.
استمر بعد 3 دقائق من هذا القياس مع التكييف الكلاسيكي ("التدريب") للذبابة.
1. حدد إحدى الروائح المعروضة في مرحلة "التدريب المسبق" لتصبح رائحة CS ⁺ وأخرى لتصبح رائحة CS. قدم رائحة CS ⁺ باستخدام نظام توصيل الرائحة الذي يتم التحكم فيه بواسطة الكمبيوتر لمدة 60 ثانية جنبا إلى جنب مع اثني عشر صدمة كهربائية بجهد 90 فولت.
2. بعد استراحة 60 ثانية ، قدم رائحة CS وحدها لمدة 60 ثانية. استخدم كروائح 4-ميثيل سيكلوهكسانول و 3-أوكتانول. لا تقدم الرائحة الثالثة (على سبيل المثال ، 1-octen-3-ol) أثناء هذا التدريب حيث يتم استخدامه كعنصر تحكم فقط قبل (الخطوة 2.2.) وبعد (الخطوة 2.4) مرحلة التدريب.
قم بقياس عابرات الكالسيوم "بعد التدريب" التي تثيرها الرائحة مرة أخرى عن طريق تكرار بروتوكول تحفيز الرائحة "قبل التدريب" (الخطوة 2.2.) بعد 3 دقائق من الانتهاء من مرحلة التدريب (الخطوة 2.3).
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يعكس توقيت هذه الخطوة وقت الاهتمام بعد تكوين الذاكرة (على سبيل المثال ، قم بتنفيذ هذه الخطوة بعد 3-4 دقائق من خطوة التكييف للتحقيق في الذاكرة قصيرة المدى). عادة ، يمكن للذباب البقاء على قيد الحياة لعدة ساعات في هذا التحضير.
احفظ ملفات التصوير بتنسيق مناسب (على سبيل المثال، Tiff) لتحليل الصور لاحقا.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات 1-أوكتين-3-أ.ل سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية [أ5284] مادة كيميائية تستخدم كرائحة 3-أوكتانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 218405 مادة كيميائية تستخدم كرائحة 4-ميثيل سيكلوهكسانول سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية 153095 مادة كيميائية تستخدم كرائحة مرشح ممر النطاق الترددي ل EGFP (525/50 نانومتر) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا الزيوت المعدنية سيجما ألدريتش ، سانت لويس ، ميزوري ، الولايات المتحدة الأمريكية م 8410 يستخدم كمخفف للروائح ليزر Ti-Sapphire Chameleon Vision 2 المقفل شركة Coherent Inc. ، سانتا كلارا ، كاليفورنيا ، الولايات المتحدة الأمريكية ليزر فيمتو ثانية بالأشعة تحت الحمراء قابل للضبط مجهر متعدد الفوتون LSM 7MP مزود بكاشفات BiG Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا المجهر متعدد الفوتون ، توفر العديد من الشركات أجهزة مماثلة. هدف الغمر المائي Plan-Apochromat 20x (NA = 1.0) Carl Zeiss Microscopy GmbH ، جينا ، ألمانيا هاتف: 421452-9900-000 الهدف W "Plan-Apochromat" 20x / 1.0 DIC M27 70mm برنامج Visual Basics of Applicatons (VBA) لتلقي مشغل من جهاز توصيل الرائحة وجهاز تطبيق الصدمات الكهربائية (مصدر الطاقة) للتفاعل مع برنامج ZEN من Zeiss الذي يتحكم في المجهر مكتوبة حسب الطلب ومتاحة عند الطلب ن. ن.

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن