$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول مقتطف من Gervaise and Arur ، التحليل المكاني والزماني ل ERK النشط في C. ايليجانس السلالة الجرثومى. J. Vis. Exp.(2016).
1. تشريح الديدان البالغة للحصول على الغدد التناسلية
- اختر 100 - 150 WT (N2) أو النمط الجيني المطلوب للديدان في مرحلة النمو المرغوبة والمحددة (L1 ، L2 ، L3 ، L4 ، البالغين ، إلخ) في 100 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 مل.
- املأ أنبوب الطرد المركزي الدقيق ب 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 (انظر جدول المواد). الطرد المركزي الأنابيب عند 1,000 × جم في جهاز طرد مركزي دقيق لمدة 1 دقيقة في درجة الحرارة المحيطة.
- قم بإزالة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 برفق وتخلص منه. قم بإزالة المخزن المؤقت تحت مجهر تشريح للتأكد من عدم إزالة الديدان عن طريق الخطأ.
- كرر الخطوات من 1.2 إلى 1.3 مرتين أخريين باستخدام المخزن المؤقت M9 الجديد في كل مرة. هذا يضمن أن أي بكتيريا تم نقلها مع الديدان يتم غسلها بشكل فعال.
- بعد الغسيل النهائي ، قم بإزالة 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 من الأنبوب وتخلص منه.
- انقل 100 ميكرولتر المتبقية من المخزن المؤقت M9 الذي يحتوي على 100-150 دودة بطرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر إلى طبق ساعة زجاجي مسطح القاع. تأكد من قطع طرف الماصة الدقيقة عند علامة 10 ميكرولتر قبل الاستخدام. سيؤدي عدم قطع الطرف إلى قص الديدان.
- أضف 1 - 3 ميكرولتر من الليفاميزول 0.1 M إلى طبق الساعة الزجاجي الذي يحتوي على الديدان في المخزن المؤقت M9. قم بتدوير الليفاميزول و M9 برفق لتمكين الخلط المتساوي حتى تتوقف الديدان عن الحركة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تخزين مخزون الليفاميزول عند -20 درجة مئوية للتخزين طويل الأجل. هنا ، استخدم تركيزا أعلى من 1-3 ملي مولار مما تم وصفه في الأدبيات 23 من 0.2 - 0.25 ملي مولار من الليفاميزول من أجل الحصول على فقدان سريع للحركة في. إذا كانت تتجول لفترة طويلة في معلق السائل ، يمكن أن تكون الأنماط الناتجة من dpERK في الغدد التناسلية متغيرة (بسبب الإجهاد أو نقص التغذية أو كليهما). تم تحقيق أنماط تلطيخ أكثر قابلية للتكرار مع 1-3 ملي ليفاميسول للتشريح.
- قم بإرفاق إبرتين 25 جم بحقنتين سعة 1 مل (لا يهم حجم المحقنة ، مقياس الإبرة أمر بالغ الأهمية). ضع حقنة واحدة في كل يد (الشكل 1).
- تحت مجهر تشريح ، ضع كل إبرة أسفل كل دودة وفوقها كما هو موضح في الشكل 1 وضع قطعا دقيقا على الدودة بالقرب من البصلة البلعومية الثانية بحركة تشبه المقص. بعد قطع واحد في الدودة ، انتقل إلى التالي حتى يتم قطع جميع الموجودة في الطبق مرة واحدة على الأقل.
<فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: ضع في اعتبارك أن الخطوات من 1.8 إلى 1.9 حساسة للوقت. قم بتشريح جميع الديدان في الطبق في أقل من خمس دقائق للحصول على نمط dpERK قابل للتكرار. ستؤدي أوقات التشريح الأطول إلى إيقاف تشغيل إشارة dpERK ، خاصة في المنطقة 1. اضبط عدد الديدان في كل جولة تشريح (أي 50 دودة مقابل 150) إذا لزم الأمر للبقاء في الإطار الزمني المخصص.
- في حالة عدم ظهور الغدد التناسلية المبثوقة أثناء التشريح ، لا تحاول قطع آخر في نفس. عادة ما يؤدي ذلك إلى قص فقط ولن يؤدي إلى بثق الغدد التناسلية. بدلا من ذلك ، انتقل إلى التالي. ستظهر الديدان التي لا تنبثق فيها الغدد التناسلية على هذا النحو على الشرائح التي سيتم إجراؤها في القسم 6 ويمكن تجاهلها أثناء التصوير
<فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: من خلال جميع خطوات التشريح والمعالجة ، من المهم أن تضع في اعتبارك أن الغدد التناسلية ستظل ملتصقة بالجسم / الذبيحة. لا تجبر الغدد التناسلية والجسم على الفصل بالإبرة. في كثير من الأحيان ، يمكن أن يؤدي التمزق الشاذ في أنسجة الغدد التناسلية في محاولة لفصل الغدد التناسلية عن الجسم إلى إشارة الأجسام المضادة الزائفة. يمكن تجاهل الجسم / الذبيحة أثناء خطوات التصوير ، وتصوير الغدد التناسلية فقط. بالإضافة إلى ذلك ، في بعض الأحيان يمكن أن تعمل الخلايا المعوية أيضا كعناصر تحكم داخلية / عناصر تحكم جسدية للجسم المضاد الذي يتم فحصه.
الشكل 1: عرض توضيحي لأوضاع الإبرة أثناء التشريح. إلى اليسار: صورة لتشريح قيد المعالجة. على اليمين: مواضع الإبرة بالإشارة إلى الدودة. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
