دودة واحدة PCR: طريقة لاستخراج وتضخيم الحمض النووي الجيني

الملخص

المصدر: Prior, H., et al. خط أنابيب سريع وسهل لتوليد طفرات النقطة الجينومية في C. ايليجانس باستخدام البروتينات النووية الريبية CRISPR / Cas9.J. Vis. Exp.(2018).

يصف هذا الفيديو تقنية لفحص الديدان الخيطية الواحدة بسرعة بحثا عن علامة وراثية عن طريق فحص تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR). في مثال البروتوكول ، نقوم بفحص تحرير الجينوم المستند إلى كريسبر.

البروتوكول

البروتوكول التالي هو مقتطف من Prior et al ، خط أنابيب سريع وسهل لتوليد طفرات النقطة الجينومية في C. ايليجانس باستخدام CRISPR / Cas9 البروتينات النووية الريبية ، J. Vis. Exp. (2018).

< p class = "jove_title" > الدودة المفردة PCR والتنميط الجيني

1. بعد 1-2 أيام من وضع البيض ، انقل F₁s إلى أغطية أنبوب شريطية PCR فردية تحتوي على 7 ميكرولتر من Worm Lysis Buffer باستخدام معول دودة (الجدول 1 ، الشكل 1D ، اليوم 4-5).
2. أنابيب PCR للطرد المركزي بأقصى سرعة لمدة 1 دقيقة في درجة حرارة الغرفة لإحضار إلى قاع الأنبوب ، وتجميد الأنابيب عند -80 درجة مئوية لمدة 1 ساعة < / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تخزين الديدان عند -80 درجة مئوية إلى أجل غير مسمى.
3. قم بتحلل الديدان المجمدة في جهاز تدوير حراري باستخدام البرنامج التالي: 60 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة ، 95 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، 4 درجات مئوية.
4. إعداد ماستر ميكس PCR كما هو موضح في الجدول 2.
5. أضف 21 ميكرولتر من ماسترميكس تفاعل البوليميراز المتسلسل إلى أنابيب تفاعل البوليميراز المتسلسل النظيفة ، ثم أضف 4 ميكرولتر من تحلل الدودة من الخطوة 3. امزج جيدا باستخدام ماصة وقم بتشغيل برنامج PCR باتباع إرشادات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد).
6. قم بتنقية تفاعلات تفاعل البوليميراز المتسلسل باستخدام مجموعة تنظيف وتركيز الحمض النووي ، باتباع تعليمات الشركة المصنعة (انظر جدول المواد). قم بإزالة الحمض النووي عن طريق إضافة 10 ميكرولتر من الماء إلى عمود الدوران.
7. إعداد إنزيم تقييد ماستر ميكس كما هو موضح في الجدول 3.
8. أضف 10 ميكرولتر من ماسترميكس إنزيم التقييد إلى كل تفاعل تفاعل البوليميراز المتسلسل نظيفا واحتضنه لمدة 1-2 ساعة عند 37 درجة مئوية.
9. منتجات PCR المهضومة المنفصلة على جل الاغاروز 1.5٪ تعمل عند 120 فولت باستخدام 1x Tris-acetate-EDTA (TAE) عازلة.

النتائج

الشكل 1. CRISPR-Cas9 هندسة C. eleganssod-1 الموضع. (أ) رسم تخطيطي يصور بنية exon-intron لموضع sod-1 في C. ايليجانس. يشير الشريط الأحمر إلى موقع G93 في exon 3. يتم ملاحظة مجموعة زوج التمهيدي بواسطة الأسهم الحمراء (F1-R1). (ب) محاذاة تسلسل البروتينات البشرية و C. ايليجانس (دودة) SOD-1. يتم تمييز بقايا G9...

المواد

<حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" نمط = "العرض: 839 بكسل ؛" العرض = "839" > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ العرض: 247 بكسل ؛ "> ماء خال من النوكلياز Synthego Inc. مزود بمجموعة sgRNA EZ kit < td style="العرض:207px;"> KCl سيغما ص 5405 DNA Clean & Concentrator زيمو للأبحاث د4004 < td height = "19" style = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > Zymoclean Gel DNA Recovery Kit زيمو للأبحاث د4002 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > Q5 بداية ساخنة عالية الدقة 2X Master Mix نيو إنجلاند بيولابيس M0494L <ارتفاع td = "19" نمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛ ">بروتيناز ك سيغما P2308 MgCl2 سيغما م 2393 < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" >NP-40 سيغما 74385 Tween-20 فيشر ساينتيك ص337-100 < td height = "19" style = "الارتفاع: 20 بكسل ؛" > RNaseZap حل إزالة التلوث فيشر ساينتيك AM9780