A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

Abstract

المصدر: Escorcia, W., et al. القياس الكمي لوفرة الدهون وتقييم توزيع الدهون في Caenorhabditis elegans بواسطة Nile Red و Oil Red O Staining. J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو بروتوكولا لتلطيخ الدهون في الديدان الثابتة الكاملة باستخدام صبغة النيل الأحمر. لعرض الدهون المحايدة على وجه التحديد في قلب قطرات الدهون ، قم بتصوير أطياف الانبعاث الأخضر ل C. ايليجانس الملطخة.

Protocol

هذا البروتوكول هو مقتطف من Escorcia et al ، القياس الكمي لوفرة الدهون وتقييم توزيع الدهون في Caenorhabditis elegans بواسطة Nile Red and Oil Red O Staining، J. Vis. Exp. (2018).

1. تلطيخ الدهون باللون الأحمر النيلي (NR)

1. تحضير محلول مخزون 5 مجم / مل NR
   1. في زجاجة سعة 500 مل ، أضف 100 مجم من مسحوق NR إلى 200 مل من الأسيتون بنسبة 100٪.
   2. قم بتغطية الزجاجة بورق الألمنيوم لتجنب التعرض للضوء.
   3. قبل الاستخدام ، حرك المحلول لمدة 2 ساعة في الظلام.
   4. للاستخدام طويل الأمد ، قم بتخزين محلول مخزون NR في زجاجة محكمة الغلق دون أي تعرض للضوء. توسيع نطاق حل مخزون NR وفقا لاحتياجات البحث. تأكد من استخدام نفس محلول المخزون عبر تجارب تلطيخ NR للحصول على نتائج تلطيخ وتصوير متسقة.
2. إعداد حل عمل NR
   1. لكل 1 مل من الأيزوبروبانول 40٪ (حجم / حجم) ، أضف 6 ميكرولتر من محلول مخزون NR.
   2. قم بإعداد 600 ميكرولتر من محلول عمل NR لكل عينة.
      ملاحظة: اصنع محلول عمل NR جديد قبل تلطيخها مباشرة. اعتمادا على احتياجات محلول مخزون NR ، استخدم إما أنبوبا مخروطيا متدرجا سعة 15 مل أو 50 مل.
3. تحضير الديدان لتلوين الدهون NR
   1. تنمو الديدان إلى مرحلة L4 المبكرة عند 20 درجة مئوية على وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) المصنفة ب OP50 E. coli المتأخر.
   2. اغسل الديدان من اللوحة ب 1 مل من محلول ملحي مخزن بالفوسفات 1x + 0.01٪ محلول Triton X-100 (PBST) وضع تعليق الدودة في أنبوب ميكرو فوج سعة 1.5 مل.
   3. قم بالطرد المركزي للديدان عند 560 × جم لمدة 1 دقيقة.
   4. أضف 100 ميكرولتر من 40٪ أيزوبروبانول إلى حبيبات الدودة واحتضانها في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 دقائق.
   قم
   5. بالطرد المركزي للديدان عند 560 × جم لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية دون تعطيل حبيبات الدودة.
      ملاحظة: استخدم كميات أكبر من PBST لغسل الديدان من الألواح إذا كنت تستخدم أطباقا أكبر أو تلطيخ المزيد من الديدان لكل طبق. لا تغسل الديدان في PBST قبل أكثر من 15 دقيقة من تثبيت العينة. قم بإجراء غسلات إضافية إذا لم يتم تنظيف المادة الطافية من البكتيريا. قم بإجراء الحضانة في 40٪ من الأيزوبروبانول باستخدام المغذيات أو الروك. راقب دائما الأنابيب للتأكد من حدوث تحريض العينة الكاملة.
4. تلطيخ الدهون ب NR
   1. في الظلام ، أضف 600 ميكرولتر من محلول عمل NR لكل عينة. اقلب الأنابيب ثلاث مرات واخلط الديدان بالكامل في محلول NR.
   2. قم بتدوير العينة في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 ساعة.
   3. بعد الحضانة ، قم بالطرد المركزي للديدان عند 560 × جم لمدة 1 دقيقة وقم بإزالة المادة الطافية.
   4. أضف 600 ميكرولتر من PBST واحتضن العينات في الظلام لمدة 30 دقيقة لإزالة بقعة NR الزائدة.
   5. قم بالطرد المركزي للعينات عند 560 × جم لمدة دقيقة واحدة وقم بإزالة جميع المواد الطافية باستثناء حوالي 50 ميكرولتر.
      ملاحظة: لا تتطلب حضانة NR تحريض. ترسيب الديدان أمر شائع خلال هذه الخطوة.
5. تحضير الشرائح للتصوير المجهري
   1. أعد تعليق حبيبات الدودة في المادة الطافية المتبقية.
   2. ضع 5 ميكرولتر من تعليق الدودة على شريحة مجهرية وضع غطاء بعناية لتجنب محاصرة أي فقاعات هواء.
   3. أغلق الغطاء بطلاء الأظافر قبل تصوير الديدان.
   4. قم بإعداد شريحتين فقط في المرة الواحدة. سيضمن ذلك بقاء تصوير NR ثابتا عبر العينات. تقل جودة الصور الملطخة ب NR بعد 6 ساعات. يصعب ملاحظة قطرات الدهون المنفصلة ويزداد مضان الخلفية ، مما يتداخل مع اكتشاف إشارة NR.
6. تصوير الديدان الملطخة ب NR
   1. قم بتصوير الديدان بتكبير 5X لالتقاط العديد من في كل مجال رؤية.
   2. قم بالتبديل إلى التكبير بمقدار 10X للحصول على تقدير أفضل للديدان الفردية.
   3. استخدم قناة FITC / GFP لتصوير الديدان الملطخة ب NR وجرب أوقات تعرض مختلفة لتحديد الظروف المثلى للقياس الكمي.
   4. احفظ الملفات بتنسيق TIF لتجنب فقدان البيانات بسبب الضغط.
      ملاحظة: تتراوح أوقات التعرض النموذجية من 100-1000 مللي ثانية. بعد أن يكون وقت التعرض الأمثل ، استخدمه لجميع العينات للحفاظ على تناسق التصوير.

Materials

Imager.M2m Microscope	Zeiss	n/a	Fluorescence microscope
ERC5s camera	Axiocam	n/a	Color-capable
MRm camera	Axiocam	n/a	Fluorescence-capable
Nile red	Thermo Fisher	N1142	Lipid Stain
Isopropyl Alcohol	BDH	BDH1133-1LP	Fixative solution
Centrifuge 5430	Eppendorf	5428000015	Centrifuge
Tube Rotator	VWR	10136-084	Rotator