تفكك الخلية المفردة ل Caenorhabditis elegans: طريقة لعزل الخلايا الحية

الملخص

المصدر: ألمانيا، إي إم، وآخرون. عزل مجموعات خلايا عصبية معينة عن الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp. (2019).

يصف هذا الفيديو طريقة لفصل الديدان الكاملة في معلق أحادي الخلية مناسب ل FACS أو الترسيب المناعي للخلايا السليمة.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من ألمانيا وآخرون ، عزل مجموعات الخلايا العصبية المحددة من الدودة المستديرة Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp.(2019).

< p class = "jove_title" >1. تحضير وجمع الديدان القديمة لعزل الخلايا

< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: موضح أدناه هو عزل الخلايا العصبية الكولينية من سلالة unc-17 :: GFP المعدلة وراثيا (OH13083) التي تم الحصول عليها من مستودع سلالة مركز Caenorhabditis لعلم الوراثة (CGC) في جامعة مينيسوتا. من الضروري الحفاظ على ظروف معقمة لمنع التلوث من الفطريات أو البكتيريا.

1. تحضير الديدان ومزامنتها عبر طريقة التبييض كما هو موضح من قبل T. Stiernagle. بالنسبة لتجارب الشيخوخة ، تتسرب الديدان الصفيحية إلى ألواح وسط نمو الديدان الخيطية (NGM) التي تحتوي على محلول مائي 25 ميكرومتر من فلوروديوكسيوردين (FuDR) لتقليل إنتاج البيض وإيقاف فقس البيض. افحص ألواح الأجار بانتظام لمنع التلوث أو فقس البيض لأن ذلك سيؤدي إلى نتائج غير موثوقة.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة لخلايا unc-17:: GFP ، عادة ما يتم استخدام ثلاث ألواح NGM مقاس 100 مم × 15 مم لعزل كمية كافية من الخلايا ذات الأهمية.
2. اجمع الديدان وقم بإعداد المخازن المؤقتة لعزل الخلايا.
   1. اجمع الديدان في أنبوب مخروطي سعة 15 مل. اغسل الديدان من الصفيحة ب 1.5 مل من المخزن المؤقت M9 (1 ملي مولار MgSO₄ ، 85 ملي كلوريد الصوديوم ، 42 ملي مولار Na₂HPO4 ·7H₂O ، 22 ملي KH₂PO ، درجة الحموضة 7.0) وجهاز الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 1,600 × جم. تخلص من المادة الطافية واغسل الديدان بسعة 1 مل من المخزن المؤقت M9. كرر الطرد المركزي واغسلها لمدة خمس مرات لإزالة أكبر قدر ممكن من تلوث الإشريكية القولونية.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن أن تساعد إضافة المضادات الحيوية (50 ميكروغرام / مل) ، مثل الأمبيسلين ، في هذه الخطوة في تقليل التلوث البكتيري.
   2. بالنسبة لعينتين ، قم بإعداد 2 مل من محلول تحلل دوديسيل كبريتات الصوديوم - ديثيوثريتول (SDS-DTT): 200 ملي مولار DTT ، 0.25٪ (وزن / حجم) SDS ، 20 ملي مولار HEPES (درجة الحموضة 8.0) ، و 3٪ (وزن / حجم) السكروز.
   3. قم بإعداد 15 مل من المخزن المؤقت للعزل (118 ملي كلوريد الصوديوم ، 48 ملي كلوريد كلوريد ، 2 ملي كلوريد_{الملكس 2} ، 2 ملي مللي كلوريد₂ ، 25 ملي هيبس [درجة الحموضة 7.3]) وقم بتخزينه على الثلج.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يكون كل من المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT والمخزن المؤقت للعزل طازجا قبل كل تجربة.
3. اضطراب البشرة وعزل الخلية المفردة
   1. تم جمع الطرد المركزي في الخطوة 1.2.1 لمدة 5 دقائق عند 1,600 × جم. قم بإزالة جميع الديدان الطافية وتعليقها في 1 مل من وسائط M9 ونقلها إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل.
   2. ديدان الحبيبات مع الطرد المركزي عند 1,600 × جم لمدة 5 دقائق.
   3. أضف 200 ميكرولتر من المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT إلى الديدان واحتضنه لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة (RT). يجب أن تبدو الديدان وكأنها "متمزقة" على طول الجسم إذا تم عرضها تحت المجهر الضوئي.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: قد يؤدي التعرض المطول للمخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT إلى موت الديدان ، والتي يمكن مراقبتها من خلال مراقبة الديدان. سوف تستطيل الديدان الميتة ولن تتجعد.
   4. أضف 800 ميكرولتر من عازل العزل المثلج البارد واخلطه عن طريق تحريك الأنبوب برفق.
   5. ديدان الحبيبات لمدة 1 دقيقة عند 13,000 × جم عند 4 درجات مئوية ، قم بإزالة المادة الطافية وغسلها ب 1 مل من المخزن المؤقت للعزل.
   6. كرر الخطوة 1.3.5 لمدة خمس مرات ، مع إزالة المخزن المؤقت للعزل بعناية في كل مرة.
   7. أضف 100 ميكرولتر من خليط البروتياز من Streptomyces griseus (15 مجم / مل) (جدول المواد) المذاب في مخزن مؤقت معزول إلى الحبيبات واحتضانه لمدة 10-15 دقيقة عند RT.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: كما هو الحال مع المخزن المؤقت لتحلل SDS-DTT ، قد يؤدي هضم البروتياز الممتد إلى انقسام مفرط للبروتينات على طول غشاء البلازما ، مما يمنع عزل GFP المكشوف للسطح عبر الخرز المغناطيسي.
   8. أثناء الحضانة بخليط البروتياز ، قم بتطبيق التعطيل الميكانيكي عن طريق سحب عينات العينة لأعلى ولأسفل على قاع أنبوب الطرد المركزي الدقيق سعة 1.5 مل بطرف ماصة دقيقة سعة 200 ميكرولتر ~ 60-70 مرة. حافظ على طرف الماصة على جدار أنبوب الطرد المركزي الدقيق بضغط ثابت لفصل الخلايا بشكل صحيح.
   9. لتحديد مرحلة الهضم ، قم بإزالة حجم صغير (~ 1-5 ميكرولتر) من خليط الهضم ، وقم بإسقاطه على شريحة زجاجية وفحصه باستخدام مجهر زراعة الأنسجة. بعد 5-7 دقائق من الحضانة ، يجب أن تكون شظايا الدودة قد قللت بشرة بشكل واضح وسيكون ملاط الخلايا مرئيا بسهولة.
   10. توقف التفاعل مع 900 ميكرولتر من وسط ليبوفيتز البارد L-15 المتاح تجاريا المكمل بمصل الأبقار الجنينية بنسبة 10٪ (FBS) والبنسلين والستربتومايسين (التركيز النهائي عند 50 وحدة / مل بنسلين و 50 ميكروغرام / مل من الستربتومايسين).
   11. حبيبات الشظايا والخلايا المعزولة عن طريق الطرد المركزي لمدة 5 دقائق عند 10,000 × جم عند 4 درجات مئوية. اغسل الخلايا المحببة ب 1 مل من الوسائط الباردة المكملة ب L-15 مرتين أخريين لضمان إزالة الحطام الزائد والبشرة.
   12. أعد تعليق الخلايا المحببة في 1 مل من الوسائط المكملة ب L-15 واتركها على الثلج لمدة 30 دقيقة. خذ الطبقة العليا ، حوالي 700-800 ميكرولتر ، إلى أنبوب الطرد المركزي الدقيق. تحتوي هذه الطبقة على خلايا بدون بقايا خلية وسيتم استخدامها في العزل اللاحق للخلايا ذات الأهمية.
   13. باتباع تعليمات الشركة المصنعة ، استخدم عداد الخلايا الآلي أو مقياس كثافة الدم لقياس كثافة الخلية من 10-25 ميكرولتر من الخلايا المعزولة.

المواد