هذا البروتوكول مقتطف من Clarke et al ، التلاعب ب Ploidy in Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2018).
يمكن التحقق من صحة سلالات
عن طريق حساب عدد الكروموسومات في بويضاتها غير المخصبة. يمكن استخدام الفحص المجهري الفلوري للكشف عن عدد أزواج الكروموسومات في البويضات ثنائية الصبغيات غير المخصبة (قبل الانقسامات الانتصافية) ، إذا كانت السلالة تحتوي على علامة فلورية للكروموسومات. في حالة عدم وجود علامات كروموسوم فلورية ، يمكن فحص الديدان الخيطية رباعية الصبغيات عن طريق تثبيت الديدان الخيطية وتلوينها بصبغة الحمض النووي. انظر أدناه للحصول على بروتوكول لتثبيت الإيثانول وتلوين الكامل 4 ′ ، 6-Diamidine-2 ′-فينيليندول ثنائي هيدروكلوريد (DAPI).
فئة
تلطيخ DAPI للحيوان الكامل
< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يمكن التحقق من صحة السلالات رباعية الصبغيات التي تحمل 12 زوجا من الكروموسومات المتصلة عن طريق تلطيخ DAPI لهذه وحساب عدد أجسام DAPI في بويضاتها غير المخصبة.
- ضع 5 إلى 10 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 على شريحة مجهرية ، ثم انقل 6-10 ديدان خيطية إلى القطرة.
- تحت مجهر تشريح ، اسحب معظم M9 من القطرة دون إزالة الديدان الخيطية بمنديل تنظيف خال من النسالة. ثم أضف على الفور قطرة 10 ميكرولتر من 90٪ إيثانول على الديدان. اترك الديدان تجف تماما ، ولكن لمدة لا تزيد عن بضع ثوان.
- بمجرد أن يتبخر الإيثانول (يمكن ملاحظة ذلك كما يحدث تحت المجهر التشريح) ، أضف 10 ميكرولتر إضافي من 90٪ من الإيثانول إلى الديدان.
- كرر الخطوة 3.1.3 ثلاث مرات أخرى.
- بمجرد تبخر آخر قطرة من الإيثانول ، أضف 6 ميكرولتر من صبغة DAPI أو Hoechst بالتركيز النهائي الموصى به في وسائط التركيب المختارة (على سبيل المثال ، تخفيف 1: 1,000 لتركيز مخزون DAPI 2 نانوغرام / ميكرولتر في M9). لتخزين الشرائح على المدى الطويل ، يمكن استخدام 0.5٪ p-phenylenediamine المذاب في 20 ملي مولار Tris-HCl ، درجة الحموضة 8.8 ، في 90٪ من الجلسرين كمحلول مضاد للبهتان ، بدلا من M9 فقط.
- قم بتغطية الديدان على الشريحة بغطاء وأغلق حواف الغطاء بطلاء الأظافر. سجل في المجهر الفلوري (الخطوة 3.1.7) بعد 10 دقائق على الأقل من إضافة الغطاء. يمكن تخزين الشرائح التي لا تحتوي على مضادات التلاشي لبضعة أيام عند 4 درجات مئوية قبل التسجيل ، لكن جودة التألق تبدأ في الانخفاض بعد بضعة أيام.
- باستخدام مجهر فلوري بتكبير 100X ، قم بتسجيل عدد أجسام DAPI المفردة (من المفترض أن تكون أزواج كروموسومات مفردة) في البويضة غير المخصبة الأكثر نضجا ، والتي تكون مجاورة مباشرة للحيوانات المنوية ولم تدخل بعد إلى المنوية أو الرحم.
- لتسجيل أجسام DAPI الفردية داخل نواة البويضة ، استخدم التركيز الدقيق للمجهر للتحرك ببطء من أعلى نواة البويضة إلى الأسفل أثناء العد. بعد ذلك ، أعد حساب نفس النواة أثناء تحريك التركيز في الاتجاه المعاكس (أي من أسفل إلى أعلى النواة) لتأكيد العدد الذي تم حسابه لأجسام DAPI.
- سجل البويضة غير المخصبة الأكثر نضجا في كل من الغدد التناسلية في ما لا يقل عن عشرة خنثى لكل سلالة لونية مستقرة. تحتوي البويضات البرية على 6 أجسام DAPI في المتوسط ، و 5 أزواج من الجسيمات الذاتية ، وزوج الكروموسوم الجنسي. يشير وجود 12 جسما من DAPI في بويضة سلالات Lon المستقرة إلى أن في هذه السلالة إما جزئية (4 مجموعات من الجسيمات الذاتية ، 3 كروموسومات X) أو كاملة (4 مجموعات من الجسيمات الذاتية ، 4 كروموسومات X) رباعيات الصبغيات.
- احسب متوسط عدد أجسام DAPI التي لوحظت من بويضات متعددة (10 على الأقل) لكل سلالة. سوف تلامس بعض أزواج الكروموسومات بعضها البعض أو فوقها مباشرة ، لذا فإن عدد أجسام DAPI في البويضة غالبا ما يكون أصغر من العدد الفعلي لأزواج الكروموسومات.
- (اختياري) تحقق من صحة سلالات Lon المستقرة حيث يكون متوسط عدد أجسام DAPI 12 لاختبار ما إذا كانت رباعيات الصبغيات كاملة (4A ، 4X) أو جزئية (4A ، 3X) عن طريق تلطيخ التألق المناعي ضد بروتينات محور الكروموسوم مثل HTP-3. سيميز هذا التلوين أزواج الكروموسومات من خلال إظهار نمط صليبي من كروموسومات مفردة غير متصلة موجودة في رباعي الصبغيات الجزئي.
