طلاء RNAi ل C. ايليجانس التغذية: تقنية للحث على التعبير عن dsRNA المستهدف في بكتريا قولونية

الملخص

المصدر: Kolundzic, E., et al. تطبيق تعبير RNAi وعامل النسخ الناجم عن الصدمة الحرارية لإعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس. J. Vis. Exp.(2018).

يصف هذا الفيديو المبادئ الكامنة وراء علاج الحمض النووي الريبي في C. ايليجانس ويوضح بروتوكولا لإسقاط لين 35 في سلالة دودة معدلة وراثيا.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتبس من Kolundzic، et al، تطبيق تعبير RNAi وعامل النسخ الناجم عن الصدمة الحرارية لإعادة برمجة الخلايا الجرثومية إلى الخلايا العصبية في C. ايليجانس، J. Vis. Exp. (2018).

1. تحضير الحل
   1. ألواح NGM-Agar (1 لتر)
      1. أضف 3 جم من كلوريد الصوديوم و 2.5 جم من وسائط الببتون (على سبيل المثال ، باكتو بيبتون) ، و 20 جم من أجار. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في 95٪ مخزون EtOH) ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl2 ، 25 مل من 1 M K2PO₄ ، و 1 مل من الأمفوتريسين B (2.5 مجم / مل مخزون).
   2. ألواح NGM-Agar RNAi (1 لتر)
      1. أضف 3 جم من كلوريد الصوديوم و 2.5 جم من وسط الببتون و 20 جم من أجار. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من الكوليسترول (5 مجم / مل في 95٪ مخزون EtOH) ، 1 مل من 1 م MgSO₄ ، 1 مل من 1 M CaCl2 ، 25 مل من 1 M K₂PO₄ ، 1 مل من الأمفوتريسين B (2.5 مجم / مل مخزون) ، 1 مل من 1 M IPTG ، و 1 مل كاربينيسيلين (50 مجم / مل
      ).
   3. LB-Agar (1 لتر)
      1. أضف 10 جم من وسائط الببتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 20 جم من أجار ، و 10 مل من 1 M Tris pH 8.0. أضف H₂O إلى 1 لتر. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من 50 مجم / مل كاربينسيلين و 2.5 مل من 5 مجم / مل من التتراسيكلين.
   4. رطل متوسط (1 لتر)
      1. أضف 10 جم من وسائط الببتون ، و 5 جم من مستخلص الخميرة ، و 5 جم من كلوريد الصوديوم ، و 10 مل من 1 م من درجة الحموضة 8.0. أضف H₂O إلى 1 لتر. بعد التعقيم ، أضف 1 مل من 50 مجم / مل كاربينيسيلين.
   5. المخزن المؤقت M9 (1 لتر)
      1. أضف 6.0 جم من Na₂HPO₄ و 3 جم من KH₂PO₄ و 5 جم من كلوريد الصوديوم و 50 مجم من الجيلاتين. قبل الاستخدام ، أضف 1 مل من 1 م MgSO₄.
   6. محلول التبييض (10 مل)
      1. أضف 1 مل من كلوريد الصوديوم و 2 مل من 5 نيوتن هيدروكسيد الصوديوم. أضف H2O إلى 10 مل.
2. تحضير ألواح RNAi
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: C. ايليجانس عادة ما يتم استزراعها في المختبر على ألواح بتري 6 سم تحتوي على 7.5 مل من أجار متوسط نمو الديدان الخيطية (NGM-Agar). تم تحسين هذا البروتوكول للديدان التي يتم الاحتفاظ بها عند 15 درجة مئوية. لتحضير الألواح التي تحتوي على NGM ، استخدم تقنيات معقمة قياسية لمنع التلوث الفطري والبكتيري. فيما يلي بروتوكول لإعداد ألواح NGM المكملة بكواشف RNAi.
   1. قم بإعداد ألواح NGM-Agar RNAi مقاس 6 سم تحتوي على 1 ملي مولار من الأيزوبروبيل β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) و 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين. دعهم يجفوا لمدة 24-48 ساعة في درجة حرارة الغرفة في الظلام¹².
      1. احتفظ بألواح RNAi عند 4 درجات مئوية في الظلام. لا تستخدمه إذا كان عمره أكبر من 14 يوما.
   2. حدد استنساخ بكتيريا RNAi (الإشريكية القولونية HT115) التي تحتوي على البلازميد L4440 مع تسلسل الحمض النووي لجين lin-53 من مخزون الجلسرين المجمد من مكتبة RNAi المتاحة على ألواح LB-agar التي تحتوي على 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين و 12.5 ميكروغرام / مل من التتراسيكلين باستخدام نمط الخطوط ثلاثي الطور. تنمو البكتيريا عند 37 درجة مئوية بين عشية وضحاها. يسمح هذا الاستنساخ بإنتاج lin-53 dsRNA المعتمد على IPTG في البكتيريا.
      1. بالإضافة إلى ذلك ، تنمو بكتيريا الحمض النووي الريبي التي تحتوي على بلازميد L4440 دون أي تسلسل جيني كعنصر تحكم في ناقل فارغ.
   3. في اليوم التالي ، اختر مستعمرة واحدة من lin-53 أو ألواح LB-agar الفارغة باستخدام طرف ماصة 200 ميكرولتر وقم بتلقيح كل منها في أنبوب استزراع منفصل يحتوي على 2 مل من وسط LB السائل المكمل ب 50 ميكروغرام / مل من الكربينيسيلين. قم بزراعة المزارع بين عشية وضحاها عند 37 درجة مئوية حتى تصل إلى كثافة بصرية (OD) عند 600 نانومتر من 0.6 - 0.8. قم بقياس OD باستخدام مقياس الطيف الضوئي.
      تنبيه: يجب ألا تحتوي وسائط LB السائلة على التتراسيكلين على عكس صفيحة LB-agar المستخدمة لإزالة البكتيريا من مخزون الجلسرين ، لأن إدراج التتراسيكلين أثناء التغذية يؤدي إلى انخفاض كفاءة الحمض النووي الريبي.
   4. أضف 500 ميكرولتر من كل مزرعة بكتيرية (lin-53 أو ناقل فارغ) إلى 6 سم من ألواح NGM-Agar RNAi باستخدام ماصة متعددة. احتضن الأطباق بغطاء مغلق طوال الليل في درجة حرارة الغرفة في الظلام حتى تجف. خلال هذا الوقت ، سيؤدي IPTG في ألواح NGM إلى إنتاج dsRNA في البكتيريا.
      1. استخدم ما لا يقل عن 3 أطباق لكل مزرعة بكتيرية لكل تجربة. سيوفر هذا 3 تكرارات تقنية لكل تجربة.
   • قم بتخزين ألواح NGM-agar RNAi المجففة مع البكتيريا عند 4 درجات مئوية في الظلام لمدة تصل إلى أسبوعين.
3. تحضير C. ايليجانس سلالة BAT28
4. حافظ على سلالة الدودة BAT28 التي تحتوي على الجينات المعدلة وراثيا otIs305 [hsp-16.2prom:: che-1 ، rol-6 (su1006)] و ntIs1 [gcy-5prom:: gfp] على بكتيريا OP50 باستخدام ألواح NGM-Agar القياسية عند 15 درجة مئوية.< / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: للاطلاع على بروتوكول مفصل حول ثقافة الديدان الخيطية ، انظر. rol-6 (su1006) هو أليل مهيمن وعلامة حقن النمط الظاهري^{شائعة الاستخدام 16} التي تسبب حركة التدحرج النموذجية. يتم استخدامه في الجين المعدل otIs305 لتتبع hsp-16.2prom :: che-1.
   1. احتفظ بسلالة BAT28 عند 15 درجة مئوية في جميع الأوقات لمنع التنشيط الحذر للجين المعدل hsp-16.2prom :: che-1. قلل من التعرض لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية أثناء التعامل مع الإجهاد قدر الإمكان.
5. لمزامنة الديدان مع العمر ، استخدم تقنية التبييض.
   1. اغسل أطباق NGM-Agar مقاس 6 سم التي تحتوي على بالغين وبيض BAT28 باستخدام 900 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9. ديدان الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 1 دقيقة. قم بإزالة المادة الطافية.
   2. أضف 0.5 - 1 مل من محلول التبييض ورج الأنبوب لمدة 1 دقيقة تقريبا حتى تبدأ الديدان البالغة في الانفجار. المراقبة باستخدام مجهر مجسمة قياسي.
   3. ديدان الحبيبات عن طريق الطرد المركزي عند 900 × جم لمدة 1 دقيقة.
   4. اغسل الحبيبات الدودية 3 مرات بإضافة 800 ميكرولتر من المخزن المؤقت M9 والطرد المركزي عند 900 × جم.
   5. ضع البيض النظيف على أطباق NGM الطازجة المغطاة ببكتيريا OP50. قم بزراعة مجموعة مبيضة على بكتيريا OP50 عند 15 درجة مئوية حتى تصل إلى مرحلة L4 (حوالي 4 أيام). يمكن التعرف على يرقات L4 بواسطة رقعة بيضاء في منتصف الطريق تقريبا على طول الجانب البطني من الدودة باستخدام مجهر مجسمة قياسي.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لتحقيق النمط الظاهري لتحويل الخلية الجرثومية إلى الخلايا العصبية عند استنفاد لين 53 ، يجب استنفاده في الجيل الأبوي (P0). يتم إجراء تسجيل النمط الظاهري للتحويل في الجيل التالي (الجيل الأبوي F1). لتحقيق المستنفد lin-53 بالفعل في P0 ، تتعرض L4 للحمض النووي
   الريبي.
6. انقل يدويا 50 ديدانا من مرحلة L4 لكل تكرار باستخدام سلك بلاتيني إلى لوحة NGM لا تحتوي على أي بكتيريا والسماح للديدان بالابتعاد عن أي بكتيريا OP50 المنقولة. دع الديدان تتحرك على الطبق لمدة 5 دقائق تقريبا. استخدم البكتيريا من صفائح NGM-Agar RNAi التي تم زرعها مسبقا ببكتيريا lin-53 RNAi (أو التحكم في النواقل الفارغة) للنقل إلى ألواح RNAi المعنية.
   1. تجنب نقل بكتيريا OP50 إلى ألواح RNAi الفعلية. اعمل بسرعة لتقليل وقت التعرض للإجهاد لدرجات حرارة أعلى من 15 درجة مئوية.
7. احتضان الديدان على ألواح NGM-Agar RNAi عند 15 درجة مئوية لمدة 7 أيام تقريبا حتى يصل نسل F1 من الديدان إلى مرحلة L3 - L4. يمكن فصلها بوضوح عن P0 لأنها أكبر وأكثر سمكا من ذرية F1.
   1. تحقق بصريا تحت مجهر مجسمة قياسي ما إذا كانت ديدان ذرية F1 تظهر النمط الظاهري البارز للفرج (pvul) كما هو موضح في الشكل 1. RNAi ضد lin-53 له تأثيرات متعددة الاتجاهات ويسبب النمط الظاهري pvul الذي يمكن استخدامه لتقييم ما إذا كان RNAi ضد lin-53 ناجحا.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يمكن أن يتسبب الحمض النووي الريبي ضد لين 53 أيضا في وفاة أجنة F1. يزداد هذا التأثير إذا تعرضت الصفائح لدرجات أعلى من 15 درجة مئوية قبل وصول إلى المرحلة L3 - L4. يمكن التعرف على الأجنة الميتة من خلال توقف التطور وقلة الفقس.
   2. احتضان الألواح في الظلام لأن IPTG حساس للضوء.

النتائج

الشكل 1: النمط الظاهري Pvul الناجم عن RNAi ضد lin-53. (أعلى) صورة DIC لديدان ذرية L4 / المرحلة الشابة F1 المشتقة من الأمهات المعالجات ب lin-53 RNAi. أشرطة المقياس = 20 ميكرومتر (أسفل) تعرض المعالجة ب lin-53 RNAi النمط الظاهري للفرج البارز (pvul) (رؤوس الأسهم السوداء). يؤكد النمط الظاهري pvul أن الحمض النووي الريبي ضد lin-53 كان ناجحا. أشرطة المقياس = 20 ميكروم...

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td > المواد الكيميائية < تي دي > < تي دي > < تي دي > < td >أجار أجار ، كوبي الأول روث 5210.1 < تي دي >باكتوبتون A. Hartenstein GmbH 211 677 بيبتون ميديا < td > مستخلص الخميرة AppliChem 1552,0100 < td >أمفوتريسين ب يو بي آيولوجي أ 2220 < td >CaCl2 ميرك للعلوم البيولوجية هاتف: 208290 < td > الكوليسترول روث 8866.2 < td >الجيلاتين روث 4275.3 < td >IPTG سيغما 15502-10 جرام < تي دي >K2PO4 روث تي 875.2 < تي دي >KH2PO4 روث 3904.2 < تي دي >MgSO4 VWR 25,163,364 ريال < تي دي >Na2HPO4 روث P030.1 < td >كلوريد الصوديوم روث 9265.1 < td >NaClO روث 9062.3 < td >هيدروكسيد الصوديوم (5 نيوتن) روث ك ك 71.1 < تي دي >تريس روث طر15.2 < td >كاربينسيلين روث 634412 < تي دي >التتراسيكلين روث 2371.2 < td >حاضنات حاضنة سانيو مير-5 5534210 للحفاظ على سلالات الدودة عند 15 درجة مئوية أو 25 درجة مئوية < td > المجاهر < td >مجهر مجسم SMZ745 نيكون سلالات بكتيرية < تي دي >الإشريكية القولونية HT115 F- ، mcrA ، mcrB ، IN (rrnD-rrnE) 1 ، rnc14 :: Tn10 (DE3 lysogen: lavUV5promoter -T7 polymerase) (بوليميراز T7 المحفز IPTG) (RNAseIII ناقص). < td >الإشريكية القولونية OP50 سلالة Uracil auxotroph E. coli سلالات الدودة BAT28: otIs305 (hsp16.2prom:: che-1::3xHA) ntIs1 (gcy-5prom:: gfp) V. مشتق من OH9846 بمقدار 4 أضعاف العبور الخلفي مع N2 < td > RNAi < تي دي >لين-53 المصدرعلم الأحياء رقم التعريف I-4D14 مكتبة Ahringer 16B07 ChromI ، K07A1.12 < td > الفتور الفارغ: L4440 أدجين #1654