تغذية الحمض النووي الريبي في الثقافة السائلة: طريقة عالية الإنتاجية للتخلص من التعبير الجيني في C. ايليجانس

الملخص

المصدر: Groh ، N. et al. طرق لدراسة التغيرات في تراكم البروتين المتأصل مع تقدم العمر في Caenorhabditis elegans. J. Vis. Exp.(2017).

RNAi هي أداة وراثية قوية متاحة لباحثي C. ايليجانس. يقدم هذا الفيديو طريقة لعلاج الديدان باستخدام الحمض النووي الريبي أكثر من تغذية الألواح باستخدام ظروف الاستزراع السائل.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Groh et al ، طرق لدراسة التغيرات في تراكم البروتين المتأصل مع تقدم العمر في Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2017).

1. الاستزراع السائل للحيوانات الخالية من الغدد التناسلية لجمع الصغيرة والمسنة المعرضة للحمض النووي الريبي الذي يستهدف الجين ذي الأهمية

< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يمكن أن تعتمد استجابة بعض الجينات على RNAi على درجة الحرارة كما هو موضح سابقا. كبديل ل RNAi ، يمكن دمج الجين المتحور في خلفية gon-2 (-).

1. تحضير البكتيريا للاستزراع السائل
   1. تحضير بكتيريا OP50 و RNAi (البكتيريا التي تنتج الحمض النووي الريبي المطلوب والبكتيريا مع الناقل الفارغ كعنصر تحكم) عن طريق تلقيح 4 لتر رطل متوسط مع 12 مل من المزرعة البكتيرية المعنية (أضف تركيزا نهائيا قدره 50 ميكروغرام / مل كاربينيسيلين و 1 ملي مولار IPTG إلى المزارع البكتيرية RNAi) واحتضانها عند 37 درجة مئوية طوال الليل عند 180 دورة في الدقيقة.
   2. في اليوم التالي ، قم بحصاد المزارع عند 6,700 × جم لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. قم بإزالة المواد الطافية وأعد تعليق كل حبيبات في 60 مل من الوسائط القاعدية S الباردة (100 ملي كلوريد الصوديوم ، 50 ملي فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6 ، المحفوظ على الجليد). احتفظ بالكريات الثلاثة المعلقة (OP50 ، وبكتيريا التحكم في الحمض النووي الريبي ، وبكتيريا الحمض النووي الريبي للجين محل الاهتمام) عند 4 درجات مئوية حتى الخطوة 1.2.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن زراعة الديدان على الحمض النووي الريبي من المرحلة L1 أو لتجنب عيوب النمو من مرحلة اليرقات الأخيرة L4 (انظر الخطوة 1.2).
2. استزراع سائل للعلاج بالحمض النووي الريبي بدءا من المرحلة اليرقية الأخيرة L4
   1. أضف 200 مل من الوسائط القاعدية S في قارورة استزراع Fernbach (سعة 2,800 مل). للحصول على حجم مزرعة نهائي يبلغ 300 مل (انظر 1.2.2.4) ، أضف 10 ملي مولار سترات البوتاسيوم ، ودرجة الحموضة 6 ، و 3 مل محلول المعادن النادرة (5 ملي مولار حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ، 2.5 ملي مولار FeSO₄ ، 1 ملي مولار MnCl₂ ، 1 ملي ZnSO₄ ، 0.1 ملي CuSO₄) ، 3 ملي مللي كلوريد_{البوتاسيوم 2} ، 100 نانوغرام / مل كاربندازيم ، و 5 ميكروغرام / مل كوليسترول). أغلق القارورة بغطاء لولبي غشائي راجع الجدول 1 للحصول على وصفات للمخازن المؤقتة.
   2. أخرج L1s من 25 درجة مئوية وانقلها إلى أنابيب سعة 15 مل. جهاز طرد مركزي عند 1,900 × جم لمدة 3 دقائق ، قم بإزالة المادة الطافية ، واحسب L1s لكل 2 ميكرولتر. أضف 500,000 L1s إلى قارورة ثقافة Fernbach المحضرة في الخطوة السابقة.
   3. أضف OP50 (من الخطوة 1.1) بما يتناسب مع عدد الديدان. على سبيل المثال ، ل 500,000 دودة ، أضف 60 مل OP50.
   4. استزراع الديدان الكامل باستخدام S قاعدي ليصل الحجم الإجمالي إلى 300 مل. احتضان مزرعة الدودة حتى المرحلة L4 عند 25 درجة مئوية في حاضنة اهتزاز بمعدل 150 دورة في الدقيقة.
   5. في اليوم التالي ، يجب أن تكون الديدان بحجم L4s من النوع البري. للتغيير من OP50 إلى بكتيريا RNAi ، اجمع في ستة أنابيب سعة 50 مل ، واتركها ترسبات وإزالة المادة الطافية. اغسل L4s ب M9 لإزالة بكتيريا OP50 المتبقية: جهاز طرد مركزي عند 1900 × جم لمدة 3 دقائق ، وقم بإزالة المادة الطافية وانقل جميع L4s إلى أنبوب واحد سعة 50 مل. عد L4s لكل 5 ميكرولتر (تسع مرات على الأقل). هناك حاجة إلى مرتين 50,000 L4s لجمع الديدان الصغيرة ومرتين 100,000 L4s لجمع الديدان القديمة.
   6. قم بإعداد أربع قوارير ثقافة فيرنباخ كما هو موضح في 1.2.2.1. أضف أيضا تركيزا نهائيا قدره 50 ميكروغرام / مل من كاربينيسيلين و 1 ملي مولار IPTG لكل قارورة.
   7. أضف بكتيريا التحكم في الحمض النووي الريبي وبكتيريا الحمض النووي الريبي للجين محل الاهتمام (من الخطوة 1.1) بالتناسب مع عدد الديدان: أضف 7 مل من البكتيريا المعنية لكل قارورة للديدان الصغيرة و 14 مل لكل قارورة للديدان المسنة.
   8. أضف 50,000 دودة لكل قارورة لمجموعة الديدان الصغيرة و 100,000 دودة لكل قارورة لمجموعة الديدان القديمة ، واستكمل المزارع باستخدام S basal لملء ما يصل إلى 300 مل. احتضان مزارع الديدان (أربعة في المجموع) عند 25 درجة مئوية و 150 دورة في الدقيقة.

< p class = "jove_title" >2. صيانة C. ايليجانس المزارع السائلة

1. اجمع حصة دورية من كل مزرعة سائلة وضعها على شريحة زجاجية (بدلا من ذلك على لوحة أجار) للتحقق من عدم وجود تلوثات. باستخدام مجهر التشريح ، تحقق من مستويات الطعام البكتيري في المزرعة خاصة خلال مرحلة النمو. قم بإعداد 2 لتر من بكتيريا RNAi للتحكم مسبقا وبكتيريا RNAi للجين المعني كما هو موضح في الخطوة 1.1. أضفها إلى C. ايليجانس المزارع السائلة إذا لزم الأمر واحتفظ بالباقي عند 4 درجات مئوية.
2. تحقق بشكل دوري من أن معقمة. لن يكون لدى غالبية غدد تناسلية. اعتمادا على اختراق طفرة gon-2 ، قد يكون لدى البعض هياكل غدد تناسلية مجهضة ولكن لا ينبغي ملاحظة أي بها بيض.

حل المخزون مبلغ التركيز النهائي تعليقات/وصف S قاعدي (لمدة 500 مل: 5.9 جم كلوريد الصوديوم ،
50 مل 1 م فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6) 200 مل 1 م فوسفات البوتاسيوم الرقم الهيدروجيني 6: ل 1 لتر: 129 جم KH2PO4 أحادي القاعدة ،
52 جم K2HPO4 ثنائي القاعدة اللامائي 1 م سترات البوتاسيوم درجة الحموضة 6
(ل 400 مل: 13.1 جم أحادي هيدرات حامض الستريك ، < / > 134.4 جم ثلاثي سترات البوتاسيوم أحادي الهيدرات) 3 مل 10 ملم محلول المعادن النزرة
(ل 1 لتر: 1.86 جم حمض الإيثيلين ديامين تترا أسيتيك (EDTA) ،
0.69 جم FeSO4 · 7 H2O ،
0.2 جم MnCl2 · 4 H2O ،
0.29 جم ZnSO4 · 7 H2O ،
0.025 [غ] [كوسو]4 · 5 [ه2و]) 3 مل قم بتخزين محلول المخزون في الظلام عند 4 درجات مئوية 1 م MgSO4 (ل 500 مل: 123.3 جم) 900 ميكرولتر 3 مللي متر 1 م CaCl2 (ل 500 مل: 73.5 جم) 900 ميكرولتر 3 مللي متر 200 ميكروغرام / مل كاربيندازيم < br / > (ل 50 مل: 10 ملغ في الميثانول) 150 ميكرولتر 100 نانوغرام / مل 5 ملغم/مل كوليسترول
(ل 100 مل: 0.5 غرام في الإيثانول) 300 ميكرولتر 5 ميكروغرام / مل < p class = "jove_content" >الجدول 1.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات قارورة ثقافة فيرنباخ كورنينج 4425-2XL بيركس ، سعة 2,800 مل ، مع 3 مسافات بادئة حاجز نعم غطاء برغي غشاء شوت 1ه + 06 GL45 نعم خلاط الجوز VWR < تي دي كولسبان = "2" >444-0148 نعم قمع منفصل نالجين 4300-1000 السعة 1,000 مل لا حقنة 1 مل BD Plastipak 3E+05 لا إبرة رمادية ، 27 جم × 1/2 بوصة ، 0.4 مم × 13 مم BD ميكرولانس 3 3E+05 لا مرشحات الغشاء 0.025 ميكرومتر ميليبور VSWP04700 لا شريط الأس الهيدروجيني ماشيري ناجل 92110 الرقم الهيدروجيني الإصلاح 0-14 لا كوكتيل مثبط البروتياز روش 5E+09 أقراص صغيرة كاملة خالية من EDTA لا أوكتوكسينول -9 أبليشم أ 1388 تريتون X-100 لا 4-حمض مورفولين إيثان سلفونيك (MES) سيجما ألدريتش م 1317 لا نونيل فينيل بولي إيثيلين غليكول أبليشم أ 1694 نونيديت P40 (NP40) لا DNaseI روش 5E+09 مؤتلف ، خال من RNase لا RNaseA بروميجا أ 7973 حل لا تلطيخ لطخة البروتين الكلية ثيرموفيشر S11791 بقعة بقعة بروتين روبي روبي لا تلطيخ جل البروتين الكلي ثيرموفيشر S12001 صبغة جل بروتين سيبرو روبي لا TCEP (تريس (2-كربوكسي إيثيل) هيدروكلوريد الفوسفين) سيرفا 36970 لا يودوأسيتاميد سيرفا هاتف: 26710 لا بيكربونات الأمونيوم سيجما ألدريتش 9830 لا تسلسل الصف المعدل Trypsin بروميجا في 5111 لا علامات متساوية الضغط للكمية النسبية والمطلقة سيكس 4E+06 مجموعة تعدد الإرسال من كواشف iTRAQ لا جهاز طرد مركزي Avanti J-26XP بيكمان كولتر 4ه + 05 نعم جهاز طرد مركزي فائق Optima Max-XP بيكمان كولتر 4ه + 05 لا جهاز طرد مركزي 5424R إيبندورف 5E+09 نعم جهاز طرد مركزي 5702 إيبندورف 6ه + 09 نعم أجهزة الطرد المركزي Megafuge 40R الترمو: العلمية 8ه + 07 لا المكثف الزائد إيبندورف 5E+09 مبخر الطرد المركزي لا مجهر ستيريو فلورسنت M165 FC لايكا مع هدف Planapo 2.0x لا مجهر تشريح لايكا لايكا S6E نعم مجهر التكبير العالي Zeiss Axio Observer Z1 زييس مع هدف PlanAPOCHROMAT 20x و Zeiss Axio Cam MRm لا برمجيات لا برنامج تحليل الصور إيمج جيه لا تحليل بيانات قياس الطيف الكتلي منقب البروتين http://prospector.ucsf.edu/prospector/mshome.htm لا سلالات الإشريكية القولونية 50 ر.ب سي جي سي بكتيريا الحمض النووي الريبي L4440 مكتبة Julie Ahringer RNAi C. ايليجانس المسوخ CF2253 CGC ، اسم السلالة: EJ1158 النمط الجيني: gon-2 (q388) C. ايليجانس الجينات المعدلة وراثيا دي سي دي 214 مختبر ديلا ديفيد في DZNE Tübingen النمط الجيني: N2 ؛ uqIs24 [Pmyo-2 :: tagrfp: :p ab-1] دي سي دي 215 مختبر ديلا ديفيد في DZNE Tübingen النمط الجيني: daf-2 (e1370) III ؛ uqIs24 [Pmyo-2 :: tagrfp: :p ab-1]