الحقن المجهري لأجنة ذبابة الفاكهة الحية: التسليم المبكر للكواشف إلى الجنين النامي

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Brust-Mascher ، I. ، Scholey ، J. M. تقنيات الحقن المجهري لدراسة الانقسام في ذبابة الفاكهة السوداء الجنين المخلوي. J. Vis. Exp. (2009).

يصف هذا الفيديو كيفية إجراء الحقن المجهري الذي ينقل الكواشف إلى أجنة ذبابة الفاكهة الحية. يمكن للباحثين استخدام هذه الطريقة لإدخال مركبات خارجية مثل الأحماض النووية والبروتينات خلال المراحل المبكرة من نمو الجنين. يوضح البروتوكول المميز كيفية إعداد وتنفيذ إجراء حقن أي كاشف قابل للذوبان - هنا ، بروتين فلوري لتجارب التصوير الحي.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Brust-Mascher and Scholey ، تقنيات الحقن المجهري لدراسة الانقسام في ذبابة الفاكهة السوداء الجرين المخلوي < style="font-size: 14px;">، J. Vis. Exp. (2009).

< p class = "jove_content" > الوصفات:

فئة

أطباق عصير العنب:

• 5.5 جرام باكتو أجار

• 14.5 غ من سكر العنب أو الجلوكوز

• 7.15 جرام سكروز

• 45 مل عصير عنب مركز (عصير 100٪).

• 204.5 مل H₂0

• 625 ميكرولتر 10N هيدروكسيد الصوديوم

< p class = "jove_content" > تخلط جميع المكونات والميكروويف حتى الغليان.
أضف 2.8 مل من مزيج الحمض (مزيج الحمض: 20.9 مل حمض البروبيونيك ، 2.1 مل حمض الفوسفوريك ، 27 مل H₂0)

< p class = "jove_content" > تخلط وتسكب على أطباق بتري مقاس 35 مم. اتركه يتماسك في درجة حرارة الغرفة لمدة يوم أو يومين. إذا لم يتم استخدام الألواح قريبا ، فقم بإغلاقها باستخدام البارافيلم واحتفظ بها عند 4 درجات مئوية (اتركها تتوازن مع RT قبل الاستخدام).

< p class = "jove_content" >معجون الخميرة:
قم بإذابة حوالي ملعقة صغيرة من الخميرة (Sigma YSC2 ، خميرة من Saccharomyces cerevisiae من النوع الثاني) في الماء لتشكيل عجينة سميكة. ضع كمية صغيرة من هذا على كل طبق عصير عنب قبل الاستخدام مباشرة.

المخزن المؤقت للحقن:

• 150 ملي K-Aspartate

• 10 ملي فوسفات ك.

• 20 ملي مولار إيميدازول ، درجة الحموضة 7.2

< p class = "jove_content" >غراء Heptane:
افرد شريطا لاصقا مزدوجا وضعه في زجاجة سعة 100 مل ، وأضف حوالي 50 مل من الهبتان ، وأغلق الزجاجة ، وصخري لعدة أيام. عند الاستخدام ، أضف الهبتان إذا كان الغراء سميكا جدا.

< p class = "jove_content" >غرفة الجفاف:
خذ طبق بتري مقاس 100 مم ، ضع جزءا واحدا من طبق 35 مم بالداخل لعمل "طاولة" وأضف Drierite (كبريتات الكالسيوم اللامائية) حوله بحيث لا يكون ارتفاع Drierite أعلى من "الطاولة" والغطاء. سيتم وضع الغطاء مع الأجنة على هذه "الطاولة" للجفاف قبل الحقن. من الجيد استخدام بعض إشارات Drierite على الأقل وتغييرها عندما يتغير لونها.

البروتوكول:
يمكن استخدام هذا البروتوكول لحقن أي كاشف قابل للذوبان تقريبا في ذبابة الفاكهة الجنين المخلوي: على سبيل المثال ، إما بروتين فلوري للملاحظة أو مثبط بروتين مستهدف أو كليهما.

< p class = "jove_title" >1. جمع الأجنة

1. ضع طبق عصير عنب جديد على القفص.
2. قم بإزالة هذا الطبق بعد ساعة واحدة ، فهذه هي المجموعة الأولى في اليوم وغالبا ما تكون ليست جيدة جدا. يمكن التخلص منها.
3. قم بتغيير اللوحة كل ساعة لمواصلة جمع الأجنة لمدة ساعة واحدة لكل منها.

< p class = "jove_title" >2. إعداد الغطاء

1. ضع غطاء 50 × 22 مم على جانب واحد من شريحة المجهر. ألصق الزوايا الأربع على الشريحة حتى لا تتحرك.
2. باستخدام قضيب قطني مائل ، ضع طبقة واحدة من غراء السباعي في سطر واحد على الغطاء (يجب ألا يكون الغراء لزجا ويجب أن يجف في بضع ثوان ، وإلا أضف المزيد من الهبتان).
3. ضع قطعة من الشريط اللاصق المزدوج على الشريحة باتجاه جانب قسيمة الغطاء.

< p class = "jove_title" >3. تحضير الجنين

< strong class = "note" > ملاحظة: يجب تصوير الأجنة بعد حوالي ساعتين من بدء التجميع ، لذا ابدأ الخطوات التالية مع إتاحة الوقت الكافي لإنهائها خلال هذا الإطار الزمني.

1. باستخدام فرشاة مبللة ، التقط الأجنة بعناية من طبق عصير العنب وضعها على شريط لاصق مزدوج على الشريحة.
2. باستخدام الجزء الخارجي من الملقط ، قم بلف الأجنة فوق الشريط اللاصق المزدوج حتى ينفتح المشيمة (الغشاء الخارجي).
3. التقط الجنين عن طريق لفه برفق فوق المشيمة حتى يلتصق بالملاقط وضعه على غراء السباعي على الغطاء مع الجانب الطويل من الجنين الموازي للجانب الطويل من الغطاء. قم بإعداد 10 إلى 20 جنينا في صف واحد.
4. قم بإزالة الغطاء وضعه في حجرة التجفيف لمدة 3 إلى 8 دقائق (هذا يعتمد على رطوبة الغرفة والكمية المراد حقنها).
5. ضعها على حجرة معدنية مع شحم مفرغ من الهواء.
6. قم بتغطية الأجنة بزيت الهالوكربون 700 لتجنب المزيد من الجفاف. الأجنة جاهزة الآن للحقن.

< p class = "jove_title" >4. حقن الأجنة

1. أوجد الأجنة تحت هدف 16x.
2. حرك الأجنة بعيدا وابحث عن الإبرة دون تحريك المستوى البؤري.
3. قم بتوسيط الإبرة وحركها لأعلى دون تحريكها في اتجاه x أو y.
4. إذا لم تكن الإبرة مفتوحة ، فضع حافة الغطاء في مجال الرؤية ، ولكن ليس حيث ستكون الإبرة ، وقم بخفض الإبرة إلى نفس المستوى البؤري. حرك الغطاء بحذر شديد حتى يصطدم بالإبرة ويفكسه برفق. إذا كانت الإبرة مفتوحة ، فانتقل إلى الخطوة 5. (يمكن فتح الإبر بحمض الهيدروفلوريك قبل التعبئة).
5. ضع الأجنة في الاعتبار (ولكن ليس في مكان الإبرة) ، وقم بخفض الإبرة في الزيت وتأكد من حصولك على قطرات سائلة لطيفة من الإبرة.
6. حرك الجنين بحذر ولكن بثبات إلى الإبرة وحقن قطرة في الجنين وحرك الجنين بعيدا. (أو اتبع تعليمات جهاز الحقن الخاص بك).
7. بعد حقن جميع الأجنة ، تكون جاهزة للمراقبة على المجهر متحد البؤر.