مقالة منهجية

تشريح الغدة الحلقية لليرقات: عزل أعضاء الغدد الصماء التنموية عن ذبابة الفاكهة

أبريل 30, 2023

في هذه المقالة

الملخص

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

المصدر: Imura، E.، et al. بروتوكولات لتصور الأعضاء الستيرويدية وأعضائها التفاعلية مع تلطيخ مناعي في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء. J. Vis. Exp. (2017).

يصف هذا الفيديو ذبابة الفاكهة الغدة الحلقية ، وهي بنية غدد صماء معقدة مهمة للتخليق الحيوي وإفراز الستيرويدات والهرمونات الأخرى. يوضح البروتوكول المميز تشريحه وتثبيته وتلوينته المناعية.

البروتوكول

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

هذا البروتوكول هو مقتطف من Imura et al. ، بروتوكولات لتصور الأعضاء الستيرويدية وأعضائها التفاعلية مع تلطيخ المناعة في ذبابة الفاكهة ذبابة الفاكهة السوداء السوداء ، J. Vis. Exp. (2017).

< strong class = "note" >ملاحظة: يظهر المخطط العام للبروتوكولات في الشكل 1.

< p class = "jove_title" >1. تشريح الغدة الحلقية اليرقية (RG)

< p class = "jove_content" >< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: في D. melanogaster ، الذي ينتمي إلى cyclorrhaphous Diptera ، يوجد PG داخل عضو غدد صماء مركب يسمى الغدة الحلقية (RG ، <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2د). نظرا لأنه من غير الممكن فصل PG جراحيا عن أنواع أخرى من الخلايا (تمت مناقشته لاحقا) ، فإن الهدف العملي هو عزل RG سليم وغير تالف عن طريق التشريح.

  1. تحضير اليرقات في مراحل النمو المناسبة
    <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لمزامنة مراحل نمو D. melanogaster يرقات ، من الضروري جمع البيض في نافذة زمنية ضيقة وجمع اليرقات في الأوقات المناسبة.
    1. اجمع البيض لمدة ساعتين على طبق أجار عصير العنب عند 25 درجة مئوية.
    2. اجمع يرقات الطور الأول حديثة الفقس تحت مجهر تشريح باستخدام ملقط وانقلها إلى قارورة صغيرة تحتوي على خميرة قياسية مهروسة / طعام ذبابة دقيق الذرة.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يتم تمثيل عمر اليرقات ب "ساعات بعد وضع البيض (hAEL)" أو "ساعات بعد الفقس (hAH)" أو "ساعات بعد L3 ecdysis (hAL3E)".
    3. في الوقت المناسب ، اجمع اليرقات المرحلية بحلقة بلاستيكية يمكن التخلص منها لتجنب الإصابة غير المرغوب فيها. لتقليل الاختلاف في التقدم التنموي لليرقات الطور الثالث ، اجمع يرقات الطور الثاني عند 70 hAEL (48 hAH) واسمح لها بالذوبان في فترات ساعتين. ثم, جمع اليرقات الطور 3 في غضون 2 ساعة بعد ecdysis L3; يعطي هذا الإجراء يرقات 0-2 hAL3E.
    4. انقل اليرقات المرحلية إلى طبق مملوء بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS).
    5. اشطف اليرقات باستخدام PBS لإزالة الطعام المتبقي من الجسم.
  2. التشريح الخشن لليرقات تحت مجهر تشريح
    1. امسك خطاف الفم من يرقة مع ملقط. اقطع جسم اليرقات في الثلث الأمامي من طول الجسم باستخدام مقص صغير.
    2. امسك الطرف المقطوع لجسم اليرقات الأمامي بزوج واحد من الملقط. باستخدام الزوج الآخر من الملقط ، ادفع طرف الرأس برفق نحو داخل الجسم ؛ يحول هذا الإجراء جسم اليرقات من الداخل إلى الخارج.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تخطي هذه الخطوة لتشريح يرقات الطور الأول.
    3. كرر الخطوات 1.2.1-1.2.2 مع يرقات إضافية لمدة 5-10 دقائق < / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يكون عدد اليرقات مساويا أو أقل من 20 لتوفير الوقت للتشريح.
  3. تثبيت وتلوين الأنسجة بالكيمياء المناعية
    1. ضع الثلث الأمامي من أجسام اليرقات (الخطوة 1.2.2) في أنبوب دقيق سعة 1.5 مل مملوء بمحلول الإصلاح 500 ميكرولتر (4٪ بارافورمالدهيد في PBS). قم بإصلاح أقل من 20 عينة في وقت واحد ، وإلا فقد يتسبب PBS المتصل بالعينات الثابتة في تخفيف غير موات للمثبت. لتشريح الشرائح ، قم بإزالة قطرة من PBS ثم أضف قطرة من محلول الإصلاح.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لمحلول الإصلاح ، يمكن استخدام 3.7٪ فورمالديهايد أو 4٪ بارافورمالدهايد.
    2. احتضان الأنسجة المقطعة في محلول الإصلاح لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة (RT) أو بدلا من ذلك لمدة ساعتين عند 4 درجات مئوية.
    3. استبدل محلول الإصلاح ب 500 ميكرولتر PBS واشطف العينات بسرعة 3 مرات. اغسل العينات ب 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT (PBS + 0.3٪ أوكتيل فينول إيثوكسيلات) لمدة 15 دقيقة على الروك في RT. لتشريح الشرائح ، قم بإزالة دبابيس الحشرات ونقل العينات إلى أنبوب دقيق سعة 1.5 مل.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لزيادة نفاذية الأجسام المضادة في الأنسجة ، تتم معالجة العينات ب 500 ميكرولتر 2.0٪ PBT لمدة 1-2 ساعة على الروك في RT.
    4. يستعاض PBT بمحلول حجب 500 ميكرولتر (2٪ ألبومين مصل بقري في PBT). احتضان العينات لمدة 1.5 ساعة على الروك في RT.
    5. استبدل محلول الحجب ب 50 ميكرولتر من محلول الجسم المضاد الأساسي ، أي الأجسام المضادة المخففة في محلول الحظر.
    6. احتضان العينات طوال الليل على هزاز عند 4 درجات مئوية.
    7. استبدل محلول الأجسام المضادة الأولية ب 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT واشطف العينات بسرعة 5 مرات. اغسل العينات 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منها على الروك في RT.
    8. يستعاض عن PBT بنسبة 0.3٪ بمحلول الأجسام المضادة الثانوية (الأجسام المضادة المترافقة بالصبغة المخففة في محلول الحظر). بالنسبة للتلوين النووي ، يضاف 0.5 ميكرولتر 4 '، 6-دياميدينو-2-فينيليندول (DAPI ، محلول مخزون 0.1 مجم / مل) إلى محلول 50 ميكرولتر. احتضان العينات على الروك لمدة ساعتين في RT أو بدلا من ذلك عند 4 درجات مئوية بين عشية وضحاها.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: احتفظ بالعينات في الظلام.
    9. استبدل محلول الأجسام المضادة ب 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT واشطفه 5 مرات. اغسل العينات 3 مرات باستخدام 500 ميكرولتر 0.3٪ PBT لمدة 15 دقيقة لكل منها في RT.
  4. تشريح دقيق لمركب الدماغ RG الذي يحتوي على PG والتركيب
    1. استخدم ماصة يمكن التخلص منها لنقل العينات الملطخة بالمناعة إلى طبق مليء بنسبة 0.3٪ PBT.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لتجنب الفقاعات غير المريحة أثناء التشريح والتركيب ، يمكن استبدال PBT بنسبة 0.3٪ ب PBS.
    2. تحت مجهر تشريح ، أمسك بشرة أو خطاف الفم بزوج واحد من الملقط. باستخدام إبرة 27 جم متصلة بحقنة سعة 1 مل ك "سكين" ، قم بقص الطرف الأمامي للمريء وأقراص العين لإزالة مركب قرص الدماغ RG والعين من بشرة الجسم.
    3. افصل المريء والأمعاء عن مركب القرص الدماغي RG والعين بالملقط. نظرا لأن المريء يمر عبر الدماغ فوق الحبل العصبي البطني (VNC) ، اسحب القناة الهضمية إلى الجانب الخلفي.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لإزالة أقراص خيالية إضافية من العينات ، قم بقطع الوصلات بين الدماغ وأقراص العين وأقراص الساق بسكين إبرة.
    4. كرر الخطوات 1.4.1-1.4.4 للعينات الأخرى.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لمنع بقايا الأنسجة من الالتصاق بالعينات ، انقل كل عينة مكتملة إلى طبق نظيف مختلف مملوء بنسبة 0.3٪ PBT أو PBS.
    5. انقل العينات إلى وسط شريحة زجاجية نظيفة باستخدام ماصة دقيقة.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة لليرقات 2 أو 3rd الطور ، يجب اقتطاع نهاية طرف الماصة الدقيقة بشفرة حلاقة.
    6. تحت مجهر تشريح ، قم بمحاذاة العينات الفردية مع جانبها الظهري لأعلى باستخدام الملقط.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يقع RG على الجانب الظهري من الدماغ (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 2أ). تسهل هذه المحاذاة مواصفات العينات الفردية أثناء التصوير.
    7. قم بإمالة شريحة زجاجية وامسح أكبر قدر ممكن من PBT الزائد. ضع قطرة من كاشف التثبيت على جانب الشريحة. ضع حافة زلة الغطاء من الجانب الآخر من القطرة وضع زلة الغطاء على العينات ببطء باستخدام ملقط.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمنع هذا الإجراء العينات من التحرك خارج زلة الغطاء.
    8. قم بتخزين العينات في درجة حرارة 4 درجات مئوية. احتفظ بالعينات في الظلام.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

النتائج

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

figure-results-1
الشكل 1: المخطط العام للبروتوكولات. هناك طريقتان مختلفتان للتشريح تنطبق على اليرقات والإناث البالغة ، اعتمادا على الغرض من التجارب. يتم أيضا تصميم طرق التركيب وفقا لظروف العينة. تقنيات التثبيت والتلطيخ والتصوير شائعة بشكل أساسي في جميع العينات. الرجاء النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.

الوصول مقيد. يرجى تسجيل الدخول أو بدء فترة تجريبية لعرض هذا المحتوى.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات جمع البيض طبق زراعة الأنسجة (55 مم) كواحد 1-8549-02 لأطباق أجار عصير العنب كوب الجمع هيكاري كاجاكو معجون الخميرة الخميرة الشرقية الجافة ، طوكيو عصير عنب 100٪ شركة ويلش للأغذية تربية اليرقات قوارير صغيرة (12 مل ، 40×23.5 مم ، PS) سارستدت 58.487 دولار حلقة يمكن التخلص منها كواحد 6-488-01 طباب الغذاء القياسي الوصفة موجودة على الموقع الإلكتروني لمركز بلومنجتون. تشريح تشريح المجهر كارل زايس ستيمي 2000-سي تشريح المجهر لايكا S8 AP0 طبق زراعة الأنسجة (35 × 10 مم ، غير معالج) إيواكي 1000-035 سيلجارد توراي السيليكون داخل الأطباق إبرة تيرومو (27 جم ، 0.40 × 19 مم) تيرومو NN-2719S "سكين" لقطع الأنسجة ملقط ، إينوكس ، # 5 Dumont, سويسرا دبوس حشرة (قطره 0.18 مم) ماركة شيجا لتشريح فيليه مقص صغير شركة NATSUME SEISAKUSHO LTD. ميغابايت -50-10 تثبيت مياه فائقة النقاء ميرك ميليبور محلول ملحي مخزن بالفوسفات (PBS) فورمالدهيد ناكالاي تيسك 16222-65 بارافورمالدهيد ناكالاي تيسك 02890-45 تريتون-X100 ناكالاي تيسك 35501-15 الأنابيب الدقيقة (1.5 مل) إينا أوبتيكا CF-0150 حضانة المرض كخلاط سويست TM-300 (هزاز) كواحد TM-300 الكرسي الهزاز ألبومين مصل الأبقار سيغما 9048-46-8 الجسم المضاد الأولي مضاد ل Sro (خنزير غينيا) ، 1: 1000 مكافحة GFP (أرنب) ، 1: 1000 المجسات الجزيئية أ 6455 شيمادا-نيوا ونيوا، 2014 مضاد GFP (ماوس mAb ، GF200) ، 1:100 ناكاراي تيسك 04363-66 مضاد ل 5HT (أرنب) ، 1:500 سيغما إس 5545 مضاد ل Hts 1B1 (ماوس) دراسات التنمية بنك الورم الهجين (DSHB) 1ب 1 مضاد ل DE-cadherin (جرذ) ، 1:20 دي إس إتش بي DCAD2 مضاد NC82 (ماوس) ، 1:50 دي إس إتش بي NC82 الجسم المضاد الثانوي الجسم المضاد الثانوي للماعز المضاد للأرانب IgG (H + L) ، Alexa Fluor 488 المترافق تقنيات الحياة أ -11008 الماعز المضاد المضاد IgG (H + L) المضاد للفأر ، Alexa Fluor 488 المترافق تقنيات الحياة أ -11001 الماعز المضاد المضاد IgG (H + L) المضاد للجرذ ، Alexa Fluor 546 المترافق تقنيات الحياة أ -11081 الجسم المضاد الثانوي لخنزير غينيا IgG (H + L) ، Alexa Fluor 555 المترافق تقنيات الحياة أ -21435 أليكسا فلور 546 القضيبين المترافق بالصبغة تقنيات الحياة أ -22283 الكواشف المتصاعدة زجاج منزلق صغير ماتسونامي الزجاج المحدودة SS7213 زجاج غطاء مجهر مربع ماتسونامي الزجاج المحدودة C218181 كاشف FluorSave (كاشف التركيب) كالبيوكيم 345789 ماصة النقل 1 مل (قطارة يمكن التخلص منها) واتسون 5660-222-1ث أسهم الطيران ث. GMR45C06-GAL4 من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 46260) UAS-GFP; UAS–mCD8::GFP هدايا من K. Ito ، جامعة طوكيو. ث [1118] ث ؛ phantom-GAL4 # 22 / UAS-turboRFP ث. UAS-mCD8::GFP; TRH-GAL4 Li، H. H. (2014) و Alekseyenko، O. V، Lee، C. & Kravitz، E. A. (2010) ث. UAS-mCD8::GFP من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 32188) yw;; nSyb-GAL4 من مركز بلومنجتون ذبابة الفاكهة. (# 51941)

إعادة الطباعة والأذونات

طلب إذن لإعادة استخدام النص أو الأشكال في مقالة JoVE هذه

طلب إذن

الوسوم

Drosophila PBS

مقالات ذات صلة