هذا البروتوكول مقتطف من Liu et al. مقايسة تدرج درجة الحرارة لتحديد التفضيلات الحرارية ليرقات ذبابة الفاكهة ، J. Vis. Exp. (2018).
1. إعداد تدرج درجة الحرارة
- تحضير التدرج أحادي الاتجاه
- لإنشاء بيئة محيطة رطبة أثناء الفحوصات ، ضع كتلتي الألمنيوم المتصلتين بحمامين مائيين على مناشف ورقية مبللة ، مفصولة ب 10 سم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
- قم بتشغيل حمامين مائيين ~ 2 ساعة قبل بدء الفحص لإتاحة الوقت الكافي لدرجة حرارة كتل الألمنيوم للتوازن.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يوصى بإجراء تجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام مائي مطلوب لتحقيق تدرج درجة الحرارة الخطي المطلوب. بعض أزواج درجات الحرارة النموذجية لضبط الحمامات المائية مذكورة في الجدول 1. ومع ذلك ، لاحظ أن درجات حرارة السطح تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. يؤثر طول الأنبوب أيضا على درجات الحرارة حيث يوجد تبريد في الأنابيب. يبلغ طول الأنبوب في إعدادنا 1.5 متر.
- الميكروويف 100 مل من 1٪ agarose في الإعداد عالي الطاقة في زجاجة مستديرة واسعة الفم سعة 500 مل وصب 25 مل / لوحة فحص على سطح منضدة مستو. قم بإعداد لوحين للفحص ، يمكن وضعهما على كتل الألمنيوم في نفس الوقت (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ).
- بعد أن يصلب الاغاروز (10-20 دقيقة) ، افرك برفق كل سطح من الأغاروز بإسفنجة مطبخ قياسية أو إسفنجة ميلامين لجعل سطح الاغاروز خشنا قليلا ، بحيث عند رش الماء على هلام الاغاروز ، سيتم إنشاء غشاء ماء رقيق ناعم ، ولن تتشكل قطرات الماء.
- اغمر الألواح بالكامل في وعاء به ماء مقطر حتى يصبح الفحص جاهزا للإجراء لمنع الجفاف من الألواح.
- إعداد تدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
- لإنشاء بيئة محيطة رطبة أثناء الفحوصات ، ضع ثلاث كتل من الألومنيوم على بعد 8 سم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب) على مناشف ورقية مبللة.
- قم بتشغيل حمامين مائيين ~ 2 ساعة قبل بدء الفحص لإتاحة الوقت الكافي لدرجة حرارة كتل الألمنيوم للتوازن.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يوصى بإجراء تجربة وهمية لتحديد درجة حرارة كل حمام مائي للتدرج ثنائي الاتجاه. بعض أزواج درجات الحرارة النموذجية لضبط الحمامات المائية مذكورة في الجدول 2. ومع ذلك ، لاحظ أن درجات حرارة السطح تتأثر بدرجة الحرارة المحيطة. يؤثر طول الأنبوب أيضا على درجات الحرارة حيث يوجد تبريد في الأنابيب. يبلغ طول الأنبوب في إعدادنا 1.5 متر.
- لمنع انسكاب الاغاروز من اللوحة ، لف حواف لوح الألمنيوم بشريط لاصق لتشكيل جدار بارتفاع 10 مم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب).
- باستخدام الإعداد عالي الطاقة ، قم بتسخين 200 مل من 1٪ agarose في زجاجة دائرية واسعة الفم سعة 500 مل وصب 120 مل على لوحة فحص.
- بعد أن يصلب الاغاروز (~ 30 دقيقة) ، افرك برفق كل سطح من الأغاروز بإسفنجة مطبخ قياسية أو إسفنجة ميلامين لجعل سطح الاغاروز خشنا قليلا ، بحيث عند رش الماء على هلام الاغاروز ، يتم إنشاء غشاء ماء رقيق ناعم ولا تتشكل قطرات الماء.
- اغمر ألواح الفحص بالكامل في وعاء به ماء مقطر حتى يصبح الفحص جاهزا للإجراء لمنعها من الجفاف.
- إعداد التدرج أحادي الاتجاه
- قم بإعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز فحص التدرج (انظر جدول المواد).
- لتعزيز نقل درجة الحرارة بكفاءة ، املأ أي فجوات بين كتل الألمنيوم وألواح الفحص عن طريق رش الماء عند الواجهة بين الكتل واللوحة.
- باستخدام القفازات ، قم بإزالة ألواح الفحص من وعاء الماء. إذا غزا الماء بين هلام الاغاروز واللوحة وتسبب في تكوين نتوءات على السطح ، فقم بإزالة الماء باستخدام ماصة دقيقة P1000.
- ضع ألواح الفحص على كتل الألمنيوم بحيث تتطابق الترسيم التي تبلغ 2 سم من أي من الحواف تماما مع حواف كتل الألمنيوم (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ ، ج).
- رش الماء على سطح اللوحة (يكفي غشاء ماء رقيق يغطي سطح الاغاروز) لمنع جفاف هلام الاغاروز. تأكد من أن غشاء الماء مستمر وخالي من قطرات الماء لأن اليرقات يمكن أن تحبس في قطرات الماء.
- قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى لتقليل تبخر الماء والمساعدة في استقرار درجة حرارة سطح الجل. انتظر لمدة 5-10 دقائق للسماح لدرجة الحرارة بالتوازن.
- تحقق من درجة حرارة السطح عند 12 نقطة على اللوحة (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ج). قم بإجراء قياسين داخل كل منطقة لتحديد ما إذا كان هناك تباين داخل المنطقة أم لا. تأكد من أن درجة الحرارة في كلتا النقطتين في حدود 0.2 درجة مئوية ± من درجة الحرارة المطلوبة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يحدث التباين داخل المنطقة عادة لأن المسافات الدقيقة للنقطتين إلى حافة كتل الألمنيوم ليست متطابقة. اضبط موضع اللوحة على كتل الألمنيوم للتأكد من أن الترسيم التي تبلغ 2 سم من أي من الحواف تتطابق تماما مع حواف كتل الألمنيوم.
- إذا انحرف تدرج درجة الحرارة المقاس عن التدرج المطلوب ، فقم بزيادة أو تقليل إعداد (إعدادات) درجة حرارة الحمام المائي وإعادة فحص درجة حرارة السطح بعد استقرار درجة حرارة الحمام (الحمامات) المائية.
- قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى حتى بدء الفحص.
- إعداد التدرج ثنائي الاتجاه (اختياري)
- قم بإعداد الكواشف والعناصر على مقعد بجوار جهاز فحص التدرج (انظر جدول المواد).
- رش الماء على أسطح كتل الألمنيوم الثلاثة لتعزيز نقل درجة الحرارة بكفاءة من كتل الألمنيوم إلى ألواح الفحص عن طريق ملء أي فجوات بين الأسطح.
- قم بإزالة ألواح الفحص بعناية من وعاء الماء وضعها على كتل الألمنيوم. إذا غزا الماء بين هلام الاغاروز واللوحة، مما قد يتسبب في تكوين نتوءات على السطح، فقم بإزالة الماء باستخدام ماصة دقيقة P1000.
- ضع لوحة الفحص على كتل الألمنيوم بحيث تتطابق خطوط الوسط للمنطقتين الأولى والأخيرة من أي من الحواف تماما مع حواف كتلتي الألمنيوم الجانبيتين (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ب ، د).
- رش الماء على سطح اللوحة (يكفي غشاء ماء رقيق يغطي سطح الاغاروز) لمنع جفاف هلام الاغاروز. تأكد من أن غشاء الماء مستمر وخالي من قطرات الماء ، حيث يمكن أن تحتجز اليرقات في قطرات الماء.
- قم بتغطية نظام التدرج بصندوق من الورق المقوى لتقليل تبخر الماء والمساعدة في استقرار درجة حرارة سطح الجل. انتظر من 5 إلى 10 دقائق للسماح لدرجة الحرارة بالتوازن.
- تحقق من درجة حرارة السطح عند نقطتين على طول خط الوسط لكل منطقة من المناطق العشر (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1د). قم بإجراء قياسين داخل كل منطقة لتحديد ما إذا كان هناك تباين داخل المنطقة أم لا. تأكد من أن درجة الحرارة في كلتا النقطتين في حدود 0.2 درجة مئوية ± من درجة الحرارة المطلوبة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يحدث التباين داخل المنطقة عادة لأن المسافات الدقيقة للنقطتين إلى حافة كتل الألمنيوم ليست متطابقة. اضبط موضع اللوحة على كتل الألمنيوم للتأكد من أن خطوط الوسط للمنطقتين الأولى والأخيرة الأقرب إلى كل حافة تتطابق تماما مع حواف كتلتي الألمنيوم الجانبيتين.
- إذا انحرف تدرج درجة الحرارة المقاس عن التدرج المطلوب ، فاضبط إعداد (إعدادات) درجة حرارة الحمام المائي وأعد فحص درجة حرارة السطح بعد استقرار درجة حرارة الحمام (الحمامات) المائية.
- قم بتغطية الكتل بصندوق من الورق المقوى حتى بدء الفحص.
2. الفحص والحساب
- قم بإزالة صندوق الورق المقوى وتحقق من درجة حرارة سطح الجل مباشرة قبل نقل اليرقات إلى اللوحة. قلل من الوقت الذي يكون فيه صندوق الورق المقوى مفتوحا لمنع تعطيل توازن درجة الحرارة. إذا كان السطح جافا ، رش كمية صغيرة من الماء على السطح.
- توزيع 150 ± 50 يرقة بالقرب من مركز كل صفيحة (بين المناطق 3 و 4 من أصل 6 مناطق) للتدرج أحادي الاتجاه (منطقة الإطلاق ؛ <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1ج) .
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه ، قم بتوزيع 200-400 يرقة على طول المنطقة الوسطى من كل نصف (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1د).
- ضع غطاء صفيحة دقيقة فوق كل لوحة فحص لمنع اليرقات من الزحف للخارج. قم بتغطية الإعداد بصندوق من الورق المقوى لمنع التعرض للضوء ، مما قد يؤثر على اختيار اليرقات على جل الاغاروز.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه ، لا ينبغي أن يكون من الضروري تغطية اللوحة بغطاء ، لأن اللوحة أكبر ، ودرجة الحرارة المفضلة لليرقات في المنطقة الوسطى. وبالتالي ، يتراكم عدد قليل من اليرقات عند الحواف ولديها فرصة للزحف للخارج.
- اسمح للمقايسة بالمضي قدما لمدة 10-30 دقيقة للتدرج أحادي الاتجاه ، ولمدة 15-35 دقيقة للتدرج ثنائي الاتجاه ، اعتمادا على عمر اليرقات (الجدول 3).
- قم بإزالة صندوق الورق المقوى وغطاء الصفيحة الدقيقة. قم بتصوير اللوحات من الأعلى باستخدام كاميرا رقمية. التقط صورتين فوتوغرافيتين لكل لوحة فحص حتى يتمكن المحقق من اختيار الصورة ذات التباين والسطوع الأفضل للتحليل.
- قم بإزالة جميع اليرقات من ألواح الفحص وفي أي مكان خارج الصفائح عن طريق الشفط.
- نظف ألواح الفحص والأنابيب ومصفاة الخلية جيدا بالماء المقطر. أعد استخدام ألواح الفحص المحضرة في ذلك اليوم ما لم يتلف سطح الاغاروز.
- احسب النسبة المئوية لتوزيع اليرقات في كل منطقة.
- افتح الصورة الفوتوغرافية لنتائج الفحص باستخدام أي برنامج يسمح بإضافة علامات إلى الصورة. للإشارة إلى مناطق الفحص ، ارسم خطوطا رأسية كل 2 سم بناء على الترسيم على لوحة الفحص.
- احسب عدد اليرقات في كل منطقة وسجل الأرقام. لا تحسب اليرقات في مناطق 0.5 سم من أي من الجدران. الجل أكثر سمكا بالقرب من الجدران ، ودرجات حرارة السطح ليست خطية في هذه المناطق.
- بالنسبة للتدرج أحادي الاتجاه ، احسب توزيع النسبة المئوية في كل منطقة على النحو التالي:
(عدد اليرقات في منطقة معينة بطول 2 سم) / (العدد الإجمالي لليرقات في 6 مناطق) × 100.
- بالنسبة للتدرج ثنائي الاتجاه ، احسب توزيع النسبة المئوية في كل منطقة على النحو التالي:
(عدد اليرقات في منطقة معينة بطول 2 سم) / (العدد الإجمالي لليرقات في 5 مناطق على كل جانب من التدرج) × 100.
