هذا البروتوكول هو مقتطف من Chiu et al. ، فحص النشاط الحركي لدراسة إيقاعات الساعة البيولوجية ومعلمات النوم في ذبابة الفاكهة ، J. Vis. Exp.(2010).
1. تحميل الذباب في أنابيب النشاط ونظام مراقبة النشاط الحركي
- قبل تحميل الذباب في أنابيب النشاط ، قم بتشغيل الحاضنات التي سيتم استخدامها لإيواء أجهزة مراقبة النشاط. اضبط درجة الحرارة باستخدام أدوات التحكم في الحاضنة واضبط نظام الضوء / الظلام باستخدام وحدة التحكم في ضوء نظام DAM أو نظام التحكم في الضوء الخاص بالحاضنات وفقا للتصميم التجريبي المطلوب. يجب أن يكون الوقت اللازم لتحميل الذباب في أنابيب النشاط كافيا لاستقرار درجة الحرارة.
- تخدير الذباب بثاني أكسيد الكربون.
- استخدم فرشاة رسم دقيقة لنقل ذبابة واحدة برفق إلى أنبوب نشاط.
- أمسك منتصف قطعة واحدة من الخيوط يبلغ طولها حوالي نصف بوصة بملقط رفيع وأدخل الخيط في الطرف غير الغذائي لأنبوب النشاط لسد الفتحة ومنع الذبابة من الهروب أثناء التجربة ، مع السماح في نفس الوقت بتدفق الهواء إلى الأنبوب. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام الأغطية البلاستيكية ذات الثقوب الصغيرة (Trikinetics، Inc.) لإغلاق الفتحة.
- تأكد من وضع الأنابيب على جوانبها حتى تستيقظ الذبابة ، وإلا فهناك خطر من التصاق الذبابة بالطعام.
- أدخل الأنابيب في أجهزة مراقبة النشاط. مع النموذج الأحدث والأكثر إحكاما لشاشات Trikinetics (Trikinetics DAM2 و DAM2-7) ، من الضروري تثبيت الأنابيب في مكانها باستخدام أربطة مطاطية لضمان أن شعاع الأشعة تحت الحمراء يمر بالأنبوب في موضع المركز.
- ضع شاشات النشاط في الحاضنات وربطها بنظام جمع البيانات عبر أسلاك الهاتف. تحقق باستخدام برنامج جمع نظام DAM للتأكد من توصيل جميع الشاشات بشكل صحيح وجمع البيانات من كل منها. تنبعث الشاشة شعاع ضوء الأشعة تحت الحمراء عبر مركز كل أنبوب نشاط زجاجي. يتم تسجيل النشاط الحركي للذباب كبيانات ثنائية خام حيث يتم تسجيل "واحد" في كل مرة يتم فيها كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء أو تسجيل "صفر" لا يتم فيه كسر شعاع الأشعة تحت الحمراء.
2. تصميم تجريبي لتسجيل البيانات لتحديد التواتر والسعة
اليومية
- تتم مزامنة الذباب وتثبيته عن طريق تعريضه للضوء / الظلام المطلوب (LD) ونظام درجة الحرارة لمدة 2-5 أيام كاملة. حالة الاحتجاز الأكثر استخداما هي دورة الضوء / الظلام لمدة 12 ساعة من الضوء / 12 ساعة من الظلام (12:12 LD) عند 25 درجة مئوية. يعتمد هذا الشرط القياسي المقبول عموما بشكل أساسي على فكرة أن ذبابة الفاكهة نشأت من مواقع أفرو استوائية. عند دراسة إيقاعات الساعة البيولوجية ، هناك بعض العبارات التي يحتاج المرء إلى التعرف عليها. فيما يتعلق بهذا البروتوكول ، يتم تعريف الوقت الذي تضيء فيه الأضواء في الحاضنة على أنه وقت zeitgeber 0 (ZT0) وجميع الأوقات الأخرى مرتبطة بهذه القيمة (على سبيل المثال ، في دورة LD 12:12 ، ZT12 هو الوقت الذي يتم فيه إطفاء الأضواء). في ظل الظروف القياسية 12:12 LD ، ذبابة الفاكهة السوداء من النوع البري عادة ما تظهر نوبتين من النشاط. أحدهما يتمحور حول ZT0 يسمى ذروة "الصباح" والآخر حول ZT12 يسمى الذروة "المسائية" (<فئة قوية = "xfig" >الشكل 1أ). يتم التحكم في نوبات الصباح والمساء بواسطة الساعة الداخلية ولكن هناك أيضا استجابات "مذهلة" عبارة عن رشقات نارية عابرة من النشاط استجابة للتحولات الفاتحة / الظلامية. يومان من الاشتراك هو الحد الأدنى ويمكن استخدامهما ، على سبيل المثال ، في الشاشات الكبيرة التي تستغرق وقتا طويلا وموجهة نحو قياس فترات التشغيل الحر في الظلام المستمر (انظر أدناه ، الخطوة 2). ومع ذلك ، إذا كنت مهتما بدراسة أنماط النشاط خلال دورة يومية للضوء والظلام ، فمن الأفضل الحفاظ على الذباب لمدة 4-5 أيام في LD للحصول على المزيد من البيانات. بشكل أساسي ، ستؤدي زيادة عدد الذباب أو عدد أيام LD في التحليل النهائي للبيانات (على سبيل المثال ، بيانات التجميع من آخر يومين من النشاط الحركي LD) إلى إنشاء ملفات تعريف وقياسات أكثر موثوقية للنشاط اليومي (على سبيل المثال ، توقيت الذروة الصباحية أو المسائية). علاوة على ذلك ، يختلف التوزيع اليومي للنشاط كدالة لطول اليوم (الفترة الضوئية) ودرجة الحرارة. أحد الأسباب الرئيسية لتغيير الفترة الضوئية أو درجة الحرارة من المعيار هو إذا أراد المرء دراسة كيفية خضوع أنماط النشاط اليومي للتكيف الموسمي (على سبيل المثال ، Chen et al. ، Cold Spring Harb Symp Quant Biol. (2007)). ذبابة الفاكهة يمكن أيضا أن تكون محطبة في دورات درجة الحرارة اليومية (مثل Glaser و Stanewsky و Curr Biol. (2005); Sehadova et al. ، Neuron (2009)). دورات درجة الحرارة التي تختلف بمقدار 2-3 درجات مئوية فقط كافية لتحفيز إيقاعات النشاط.
- يتم قياس إيقاعات النشاط الحركي للجري الحر في ظل ظروف ظلام ودرجة حرارة ثابتة بعد انتهاء فترة الاحتباس (انظر أعلاه ، الخطوة 1). يمكن تغيير إعداد دورة الضوء في أي وقت في المرحلة المظلمة في اليوم الأخير من LD بحيث يمثل اليوم التالي من التجربة اليوم الأول من DD. سبعة أيام من جمع بيانات DD كافية لحساب الفترة اليومية والسعة (على سبيل المثال ، قوة أو قوة إيقاع) الذباب. بشكل عام ، يعد حجم عينة لا يقل عن 16 ذبابة ضروريا للحصول على فترات تشغيل حرة موثوقة لنمط وراثي معين. حتى لو كان المرء مهتما فقط بقياس النشاط النهاري ، فلا يزال من الأفضل قياس فترات الجري الحر للذباب في DD لأن التغييرات في الفترة الداخلية يمكن أن تغير التوزيع اليومي للنشاط في LD. على سبيل المثال ، عادة ما يظهر الذباب ذو الفترات الداخلية الطويلة قمم مسائية متأخرة في LD (على سبيل المثال ، انظر <فئة قوية = "xfig" >الشكل 2).
- في ختام التجربة ، يتم تنزيل البيانات الثنائية الأولية التي تم جمعها باستخدام برنامج نظام DAM على جهاز تخزين بيانات محمول ، مثل مفتاح USB.
- تتم معالجة البيانات الثنائية الأولية باستخدام DAM Filescan102X (Trikinetics، Inc.) ويتم جمعها في صناديق مدتها 15 و 30 دقيقة عند تحليل معلمات الساعة البيولوجية ، أو صناديق من 1 إلى 5 دقائق عند تحليل معلمات النوم / الراحة. حاليا ، خمس دقائق متجاورة من الخمول هي التعريف القياسي للنوم / الراحة في ذبابة الفاكهة (Hendricks et al. ، Neuron (2000). هو وسيغال ، طرق إنزيمول ، (2005)).
- هناك العديد من الطرق المختلفة لتحليل البيانات التي تم جمعها على نظام DAM ولكننا سنوفر فقط تلك الطرق المستخدمة بشكل روتيني في مختبرنا. يستخدم Microsoft Excel لتعيين النمط الجيني لمجموعات عينات مختلفة. برنامج FaasX (M. Boudinot و F. Rouyer ، المركز الوطني للبحث العلمي ، Gif-sur-Yvette Cedex ، فرنسا) أو Insomniac (برنامج قائم على Matlab ؛ تستخدم ليزلي أشمور ، جامعة بيتسبرغ ، بنسلفانيا) لفحص معايير الساعة البيولوجية (مثل الفترة والقوة) أو النوم / الراحة (مثل النسبة المئوية للنوم ، متوسط طول نوبة الراحة) على التوالي.
