$$\rightleftharpoonup{xx}$$
$$\longleftharp{xx}$$,
$$\longrightharp{xx}$$,
هذا البروتوكول هو مقتطف من de Vries and Clandinin ، التحفيز البصري الوراثي لسلوك الهروب في ذبابة الفاكهة السوداء ، J. Vis. Exp.(2013).
1. إنشاء ذباب Channelrhodopsin
- يطير Cross UAS-ChR2 مع برنامج تشغيل Gal4 الذي تختاره ، نستخدم G105-Gal4 ، والذي يتم التعبير عنه في الخلايا العصبية Foma-1 في الفص البصري.
- للقضاء على إمكانية الاستجابة البصرية لتحفيز الضوء الأزرق ، يكون كلا خطي الطيران في خلفية w + norpA.
- النتيجة النهائية: w + norpA; G105-Gal4 / UAS-ChR2 +
- بعد أن يغلق الذباب البالغ ، ضع الإناث المختارة على طعام طازج ، مع استكمال 10 ميكرومتر بالكامل عبر الشبكية (عامل مساعد مطلوب ل ChR2) ومحمي من الضوء ، لمدة 3 أيام قبل إجراء الفحص السلوكي.
فئة
2. اصنع 10 ميكرومتر طعام محسن عبر شبكية
العين بالكامل
- قم بإذابة 100 مجم من الشبكية بالكامل في 17.6 مل من الإيثانول بنسبة 95٪ لصنع 20 ملي مولار من الشبكية. حافظ على حماية الشبكية بالكامل من الضوء في جميع الأوقات.
- قم بإذابة طعام ذبابة دقيق الذرة القياسي في الميكروويف ، واتركه يبرد حتى يسخن الملمس.
- امزج 50 ميكرولتر من 20 ملي من الشبكية بالكامل في قوارير تحتوي على 10 مل من طعام الذباب.
- دع القوارير تبرد وتبقى محمية من الضوء.
< p class = "jove_title" >3. المعدات
- أطراف الماصة: يتم قطع أطراف الماصة القياسية سعة 1,000 ميكرولتر بالقرب من الحافة، مما يؤدي إلى قطر مسام يبلغ ~ 2.25 مم.
- النظام الأساسي (انظر <الفئة القوية = "xfig">الشكل 1).
تم - بناء قاعدة Delrin ، 17 سم × 25 سم ، بفتحات ملولبة في كل زاوية لتناسب موصلات خرطوم سائل التبريد NPT مقاس 1/4 بوصة.
- حامل عمودي ، مصنوع من Delrin ، متصل بمركز القاعدة. الأبعاد الكلية 25 مم × 40 مم × 65 مم (العرض × العمق × الارتفاع). يمتد أخدود بعرض 10 مم بطول الحامل ، مع برغي إبهام في الأسفل. يتم توصيل منصة بالجزء العلوي من الحامل ، 25 مم × 40 مم × 10 مم ، مع فتحة قطرها 3.5 مم محاذاة مع الأخدود الموجود في الحامل.
- مصفوفات LED (انظر <فئة قوية = "xfig" >الشكل 1).
- يتم تثبيت أربعة أذرع من خرطوم سائل التبريد ، بطول ~ 18 سم ، على قاعدة المنصة باستخدام موصل خرطوم سائل التبريد. يستخدم خرطوم سائل التبريد فقط كدعم هيكلي ولا يستخدم لأغراض التبريد.
- يتم قطع الأخاديد المتباعدة بشكل صحيح في القطعة الأخيرة من خراطيم سائل التبريد لكل ذراع لتثبيت بالوعة حرارية في نهاية كل ذراع.
- يتم تثبيت LED Rebel Tri-Stars الأزرق على كل بالوعة حرارية باستخدام شريط لاصق حراري مقطوع مسبقا. يتم لصق عدسة Carclo 18 ° Tri على كل ثلاثي النجوم.
يتم - توصيل LED Tri-Stars ببرامج تشغيل BuckPuck DC ومصدر طاقة كما هو محدد. لقد رتبنا إعدادنا مع كل BuckPuck لتشغيل اثنين من Tri-Stars في سلسلة.
- أسفرت إضاءة جميع النجوم الثلاثية LED الأربعة عند 700 مللي أمبير عن إشعاع 713 واط / م2 على منصتنا.
- الكاميرا: الكاميرا مثبتة على حامل ثلاثي القوائم صغير وتركز على الجزء العلوي من المنصة.
< p class = "jove_title" >4. الفحص السلوكي
- باختصار تخدير الذباب على الجليد.
- ضع الذباب الفردي في أطراف الماصة ، باستخدام شريط لاصق لإغلاق طرفي الحافة.
- بعد أن يستيقظ الذباب ويستكشف بنشاط طرف الماصة ، قم بإزالة الشريط وضع ماصة في الأخدود في الحامل الرأسي. يتم استخدام المسمار اللولبي لتثبيت طرف الماصة في مكانه وإغلاق الجزء السفلي من الطرف.
- عندما تستكشف الذبابة طرف الماصة (عادة من 30 إلى 60 ثانية)، ابدأ تسجيل الكاميرا قبل خروج الذبابة من الطرف إلى المنصة.
- بعد ظهور الذبابة على المنصة ، انتظر 1-2 ثانية ، وقم بتشغيل مصابيح LED الزرقاء. استخدم مؤقتا لقياس الوقت يدويا حتى تبدأ الذبابة الرحلة.
