تحضير ذبابة الفاكهة القلب: تقنية لدراسة فسيولوجيا القلب في الذبابة البالغة

الملخص

المصدر: Vogler ، G. ، Ocorr ، K. تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة. J. Vis. Exp. (2009).

يصف هذا الفيديو قلب الذبابة البالغ ، أو يسمى الوعاء الظهري ذبابة الفاكهة. يوضح البروتوكول المميز إجراء تشريح لمستحضرات القلب الحي.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Vogler and Ocorr ، تصور القلب النابض في ذبابة الفاكهة ، J. Vis. Exp. (2009).

1. قبل البدء

محلول
1. هيموليمف اصطناعي محضر حديثا يحتوي على 108 ملي مولار Na ⁺ ، 5 ملم K + ، 2 ملم Ca²⁺ ، 8 ملي ملي MgCl₂ ، 1 ملي هيدروهيدرات_{هيدروكسيد 2}PO₄ ، 4 ملي NaHCO₃ ، 10 ملي سكروز ، 5 ملي تريهالوز ، 5 ملي هيبس (درجة الحموضة 7.1 ، جميع الكواشف من سيجما للكيماويات). يجب إضافة السكروز والتريهالوز إلى AH من محاليل المخزون المبردة قبل الاستخدام مباشرة لمنع التلوث البكتيري.
2. قم بإحضار AH إلى درجة حرارة الغرفة وقم بتزويد المحلول بالأكسجين عن طريق فقاعات الهواء لمدة 15 دقيقة على الأقل.
3. اسحب العديد من الشعيرات الدموية الدقيقة (مثل الشعيرات الدموية الزجاجية ، 100ul ، VWR) المطلوبة لإزالة الدهون.

< p class = "jove_title" >2. ذبابة الفاكهة شبه سليمة القلب من الذبابة البالغة

1. يتم تخدير ذبابة الفاكهة البالغة باستخدام Fly Nap (شركة Carolina Biological Supply Co.) لمدة 2-5 دقائق. يجب الحرص على عدم ترك الذباب في قيلولة الطيران للتعرضات لفترة أطول. يمكن أيضا استخدام التعرض قصير المدى للبرد لتخدير الذباب ولكن لا ينصح باستخدام ثاني أكسيد الكربون₂ لأنه له تأثيرات طويلة الأمد على معدل ضربات القلب والإيقاع.
2. يتم وضع الذباب المخدر ، بحيث يكون الجانب الظهري لأسفل ، في طبق بتري مغطى بطبقة رقيقة من الفازلين. البشرة الكارهة للماء في الأجنحة والجسم "تلتصق" بالهلام بشكل عكسي ولكن يمكن إعادة وضع الذبابة إذا لزم الأمر. يصبح هذا مهما بشكل خاص أثناء التلاعب اللاحق.
3. يتم إجراء القطع الأولي باستخدام زوج منحني من مقص الزنبرك (Roboz # 5611). توضع شفرات المقص تحت الساقين ومائلة لأسفل باتجاه السطح الظهري للصدر بالقرب من الرقبة. تتم إزالة الرأس والحبل العصبي البطني والساقين بقطع واحد. ثم يتم غمر المستحضر في محلول هيموليمف اصطناعي مؤكسج (AH).
4. باستخدام مقص زنبركي ، تتم إزالة الطرف الخلفي للبطن (يتكون من أجزاء البطن 7 و 8) بقطع واحد. يوفر هذا الوصول لعمل جروح جانبية على طول طرفي البطن ويعمل على قطع الاتصال بين الأمعاء الخلفية وبشرة البطن. ثم تتم إزالة السديلة المحررة لبشرة البطن البطنية.
5. في الخطوتين 3 و 4 ، يتم قطع الوصلات الأمامية والخلفية للأمعاء ، لذلك يتم الآن تثبيت أعضاء البطن في مكانها فقط بواسطة القصبات الهوائية. يمكن عادة إزالة الأمعاء وأعضاء البطن الأخرى ككتلة واحدة باستخدام ملقط الصائغ (Roboz ، # 55) والشد اللطيف. تكشف إزالة الأعضاء الداخلية عن أنبوب القلب النابض الذي لا يزال متصلا بالبشرة الظهرية المحاطة بأجسام دهنية.
6. الأجسام الدهنية معتمة تماما في المجهر الضوئي وبالتالي غالبا ما يكون من الضروري إزالة بعض هذه الدهون من أجل رؤية أنبوب القلب بوضوح. يتم تحقيق ذلك عن طريق تقنية شفط الدهون باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية المرسومة بدقة. تصنع الشعيرات الدموية باستخدام مجتذب ماصة قياسي (على سبيل المثال Sutter P-97 Pipette Puller) ثم يتم إدخالها في أنابيب بلاستيكية (Tygon ، 1/16 بوصة) متصلة بمصدر تفريغ. يستخدم هذا النظام لشفط الدهون الزائدة من حول أنبوب القلب. تتناسب قوة الشفط مع قطر الطرف، لذا لا ينبغي استخدام الماصات ذات الأطراف التي يزيد قطرها عن 40 ميكرون. يجب توخي الحذر الشديد لتجنب لمس القلب نفسه ولأن الجزء الخلفي من القلب هش للغاية ، يجب تجنب هذه المنطقة تماما.
7. ذبابة الفاكهة البالغة أنبوب القلب مكشوف الآن ويجب أن ينبض. إذا لزم الأمر ، يمكن إعادة وضع البشرة والقلب المتصل بها عن طريق رفع البشرة برفق من الفازلين ودكها بعناية لأسفل ، وتجنب أي ملامسة لأنسجة القلب مرة أخرى. في هذه المرحلة ، يجب استبدال المحلول الذي يستحم المستحضر ب AHL الطازج. يجب السماح لهذا المستحضر بالتوازن لمدة 20-30 دقيقة مع الأكسجين قبل أي تلاعب. إذا كان سيتم الحفاظ على المستحضر لمدة تزيد عن 60 دقيقة ، فيجب أن يتم تزنيعه ب AHL الطازج.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات مقص زنبركي تشريح دقيق (منحني) شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5611 جيد للتخفيضات الإجمالية (الخطوة 2) مقص زنبركي تشريح دقيق (مستقيم) شركة روبوز للأدوات الجراحية RS-5620 ملقط دومون # 55 أدوات العلوم الدقيقة 11295-51 ملقط دومون # 5 أدوات العلوم الدقيقة 11295-10 الشعيرات الدموية الزجاجية ، غرامة منتجات علمية GB100T8P مجتذب الماصة معدات سوتر ف-97 ستعمل كل من ساحبات الماصات الأفقية والرأسية أنابيب بلاستيكية تيجون 1/16 "القطر الداخلي ل 100 ميكرولتر من الشعيرات الدموية لاصق الأنسجة الهيستواكريل® ب. براون الطبية