ج. ايليجانس تشريح الأريمة: طريقة لإزالة قشر البيض وفصل الخلايا الجنينية

الملخص

المصدر: Hsu, C.R., et al. في المختبر إعادة التشكيل لأنماط التلامس الخلوية المكانية مع التهاب الغدد العصيبي المعزول ، والأريمات الجنينية وحبات البوليسترين اللاصقة.J. Vis. Exp.(2019).

يقدم هذا الفيديو طريقة لعزل C. ايليجانس الأريمية من الأجنة المبكرة. الخلايا الناتجة مناسبة لزراعة الخلايا أو تجارب خارج الجسم الحي.

البروتوكول

هذا البروتوكول هو مقتطف من Hsu et al ، إعادة التشكيل في المختبر لأنماط التلامس الخلوية المكانية مع Caenorhabditis Elegans المعزولة Embryo Blastomers وحبات البوليسترين اللاصقة ، J. Vis. Exp.(2019).

1. عزل الجنين الأريمي
2. ارتد قفازات ومعطف مختبر لتجنب القطع والتلامس مع محلول التبييض.
   1. امسك كل طرف من الشعيرات الدموية الدقيقة (السعة ؛ 10 ميكرولتر) باليد اليمنى واليسرى.
   2. اسحب الشعيرات الدموية الدقيقة باتجاه كلا الطرفين لتطبيق الشد وإحضار مركز الشعيرات الدموية فوق الموقد لعمل شعيرات دموية مسحوبة يدويا (الشكل 1 أ).
   3. قم بقص أطراف الشعيرات الدموية المسحوبة يدويا باستخدام ملقط تحت المجهر التشريحي وقم بتوصيل الشعيرات الدموية المسحوبة بجهاز سحب الفم. تحضير نوعين من الماصات. يجب أن تكون أحجام فتح الأطراف للماصات حوالي 2x و 1x طول المحور القصير ل C. elegans أجنة (30 ميكرومتر) لنقل الأجنة وإزالة قشر البيض ، على التوالي الشكل 1B-D).
   4. ماصة 45 ميكرولتر من محلول ملح البيض على بئر شريحة متعددة الآبار (الشكل 2 أ ؛ أسفل).
   5. ضع 5-10 ك. ايليجانس البالغين في محلول ملح البيض الذي يحتوي على بئر.
   6. للحصول على C. ايليجانس المبكر ، قم بتقطيع البالغين إلى قطع عن طريق وضع إبرتين على يمين ويسار C. ايليجانس الجسم وتحريك الإبر عبر بعضها البعض (الشكل 2 أ ؛ المخططات العلوية).
   7. ماصة 45 ميكرولتر من محلول هيبوكلوريت على بئر بجوار البئر الذي يحتوي على محلول ملح البيض (الشكل 2 ب).
   8. الماصة 45 ميكرولتر من وسط نمو شيلتون على الآبار الثلاثة اللاحقة بجوار البئر المحتوي على محلول هيبوكلوريت (الشكل 2 ب).
   9. انقل الأجنة المكونة من خلية واحدة ومرحلة 2 خلية مبكرة إلى محلول هيبوكلوريت عن طريق سحب العينة عن طريق الفم باستخدام الشعيرات الدموية المرسومة يدويا لنقل الأجنة (الشكل 2 ب).
   10. انتظر 40-55 ثانية.
   11. اغسل الأجنة عن طريق نقل الأجنة من محلول هيبوكلوريت إلى وسط نمو شيلتون عن طريق سحب العينات الفموية باستخدام الشعيرات الدموية المرسومة يدويا لنقل الأجنة (الشكل 2 ب).
   12. اغسل الأجنة مرة أخرى عن طريق نقل الأجنة إلى بئر جديد من وسط نمو شيلتون عن طريق سحب العينات الفموية باستخدام الشعيرات الدموية المرسومة يدويا لنقل الأجنة (الشكل 2 ب).
   13. انقل الأجنة المغسولة إلى بئر جديد من وسط نمو شيلتون عن طريق الماصة الفموية باستخدام الشعيرات الدموية المسحوبة يدويا لنقل الأجنة. باستخدام الشعيرات الدموية المرسومة يدويا لإزالة قشر البيض، كرر سحب العينات بعناية (الشكل 2C؛ المخططات الوسطى). إذا تمت إزالة قشر البيض بنجاح ، فستصبح الخلايا الجنينية أكثر كروية (الشكل 2 ج ؛ يمين).
   14. افصل بين الأريمات الجنينية المكونة من خلية عن طريق سحب العينة برفق وبشكل مستمر باستخدام الشعيرات الدموية المرسومة يدويا لإزالة قشر البيض (الشكل 2 د).

الشكل 1: عزل المبلمة.(أ) سحب اليد للشعيرات الدموية الزجاجية. (ب) الشعيرات الدموية الزجاجية المرسومة يدويا لنقل الأجنة. (ج) الشعيرات الدموية الزجاجية المرسومة يدويا لإزالة قشر البيض. (د) مخططات توضح الحجم المناسب للفتحة الشعرية لإزالة قشر البيض. تشير الأسهم إلى الأجنة. تظهر أشرطة المقياس 100 ميكرومتر.

< p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 2: سير عمل عزل Blastomere.(أ) تشريح البالغين C. ايليجانس في محلول ملح البيض للحصول على أجنة. تظهر الصور أجنة من خلية و 4 خلايا قبل إزالة قشر البيض. (ب) معالجة هيبوكلوريت وغسيله. (ج) تصور المخططات التوقيت المناسب لإزالة قشر البيض. تظهر الصورة جنينا مكونا من 4 خلايا بعد إزالة قشر البيض. (د) فصل المبلمة. تظهر الصورة جنينا منفصلا من خلية 2. تشير أحجام الأسهم في C و D إلى القوى النسبية المطلوبة أثناء سحب العينات. تظهر أشرطة المقياس 50 ميكرومتر.

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td > مجموعة أنبوب الشفاط < تي دي >دروموند < تي دي >21-180-13 لعزل البلاستومير. سلالة Caenorhabditis elegans: N2 ، من النوع البري مركز علم الوراثة Caenorhabditis N2 السلالة المستخدمة في هذه الدراسة Caenorhabditis elegans سلالة: KSG5 ، النمط الجيني: zuIs45 ؛ itIs37 في المنزل KSG5 السلالة المستخدمة في هذه الدراسة ميركوبيبيتس معايرة، 10 ميكرولتر دروموند 21-180-13 لعزل المبلاستومير < TD > CD مركز الدهون تقنيات الحياة 11905031 لعزل البلاستومير. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة. < تي دي >كلوركس كلوركس ن. أ. لعزل البلاستومير. افتح زجاجة جديدة عندما لا يعمل علاج هيبوكلوريت بشكل جيد. < td >حامل غطاء في المنزل ن. لعزل البلاستومير. < td >مجهر تشريح: Zeiss Stemi 508 مع حامل M. مصدر الضوء هو LED مدمج. تكبير قطعة العين 10X. كارل زايس ستيمي 508 لعزل البلاستومير. مصل بقري الجنين ، مؤهل لقطة واحدة ، أصل كندي جيبكو A3160701 لعزل البلاستومير. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة. الاستخدام العام والدقة انزلاق الإبر تحت الجلد ، مقياس 25 دينار بحريني 14-826 أ لعزل المبلاستومير < td > إينولين ألفا إيسار AAA1842509 لعزل المبلاستومير < TD > محلول فيتامين MEM (100x) جيبكو 11120052 لعزل البلاستومير. شريحة متعددة الاختبار 10 جيدا MP الطب الحيوي ICN6041805 لعزل المبلاستومير البنسلين الستربتومايسين (10,000 وحدة / مل) جيبكو 15140148 لعزل البلاستومير. < تي دي >بولي فينيل بيروليدون فيشر الكواشف الحيوية بي ت 431-100 لعزل المبلاستومير < td > كلوريد البوتاسيوم بيوشوب بوك 888 لعزل المبلاستومير ذبابة الفاكهة المعقمة المتوسطة من شنايدر جيبكو 21720024 لعزل البلاستومير. العمل في غطاء مزرعة الأنسجة. < td > كلوريد الصوديوم بيوشوب SOD001 لعزل المبلاستومير محلول هيدروكسيد الصوديوم ، 10 نيوتن فيشر للكيماويات SS255-1 لعزل المبلاستومير < td > مرشحات الحقن ، PTFE ، غير معقمة باسيكس 13100115 لعزل البلاستومير. < td >Tygon S3 Laboratory Tubing,, صيغة E-3603, القطر الداخلي 3.175 مم سانت جوبين للبلاستيك عالي الأداء 89403-862 لعزل البلاستومير. < td > Tygon S3 Laboratory Tubing ، الصيغة E-3603 ، القطر الداخلي 6.35 مم سانت جوبين للبلاستيك عالي الأداء 89403-854 لعزل البلاستومير.