ج. ايليجانس فحص الانجذاب الكيميائي: طريقة لاختبار التحسس الكيميائي في الديدان

الملخص

المصدر: Campbell ، J. C. ، et al. A Caenorhabditis elegans اختبار النفور من النحاس القائم على الحالة التغذوية. J. Vis. Exp. (2017).

يقدم هذا الفيديو الانجذاب الكيميائي في الديدان الخيطية C. ايليجانس ويظهر عينة من بروتوكول يختبر النفور الكيميائي من كبريتات النحاس.

البروتوكول

البروتوكول التالي هو مقتطف من Campbell et al ، A Caenorhabditis elegans Nutritional-Status Stem Acur Assay ، J. Vis. Exp. (2017).

1. تحضير الكائنات الحية التجريبية
   1. اختر 10 ديدان خيطية L4 لكل سلالة قبل 24 ساعة من بدء الفحص للتأكد من أن الكائنات الحية هي شباب عند الاختبار. لكل ديدان خيطية متحولة أو تحكم تم اختبارها ، اختر 10 L4s (10 للتحكم و 10 للمقايس).
      1. الحفاظ على الكائنات الحية L4 باستخدام الطرق القياسية لمدة 24 ساعة على ألواح الأجار القياسية المصنفة ب OP50 الإشريكية القولونية. إذا فقدت الكائنات الحية أثناء خطوات الغسيل اللاحقة ، فقم بالتعويض عن طريق زيادة حجم العينة الأولية (أي اختر 20 دودة بدلا من 10).
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: السلوك هو نمط ظاهري متغير بالفطرة. قم بتنفيذ الطريقة ثلاث نسخ لكل سلالة في ثلاثة أيام منفصلة. قم بتضمين سلالات وشروط تحكم إضافية للسلالات الجديدة ، كما هو موضح في قسم المناقشة.
   2. مباشرة قبل الفحص ، انقل الكائنات الحية التجريبية إلى صفيحة أجار خالية من البكتيريا واسمح للديدان الخيطية بالتحرك بحرية لمدة دقيقة واحدة لإزالة البكتيريا الزائدة.
      1. إذا واجهت الكائنات الحية التجريبية ظروف تلوث خلال ال 24 ساعة السابقة للفحص ، فتخلص منها.
   3. ماصة 1 مل من M9 على الصفيحة الخالية من البكتيريا لغسل الديدان في أنبوب الطرد المركزي الدقيق.
   4. جهاز طرد مركزي عند 3,000 × جم لمدة 1 دقيقة. شفط محلول M9 دون تعطيل الحبيبات الدودة. أضف 1 مل من M9 إلى حبيبات الدودة ، واقلب الأنبوب لخلط الديدان مع المحلول.
   5. كرر الخطوات 1.4 ثلاث مرات أخرى.
      1. إذا تم نقل البكتيريا الزائدة في البداية مع الديدان ، كرر ذلك لمدة 5 مرات. لا ينبغي نقل أي بكتيريا إلى ألواح سباق الطعام النحاسية. إذا تم نقل الطعام إلى لوحة الفحص ، فسوف يتداخل مع جمع البيانات بدقة.
   6. بعد الغسيل النهائي ، قم بشفط المادة الطافية حتى 100 ميكرولتر من M9 وتبقى حبيبات الدودة.
      تحذير: تصبح السلوكيات المتعلقة بالجوع واضحة بعد 30 دقيقة. وبالتالي ، يجب نقل الديدان على الفور من المحلول بمجرد اكتمال خطوات الغسيل.
2. تحضير لوحات الفحص
   1. قم بإعداد ألواح أجار NGM القياسية قبل يومين من الفحص.
      1. إذا تم الاحتفاظ بالأطباق في بيئة رطبة ، فقم بعمل ألواح أجار قبل 3 أيام من الفحص. بدلا من ذلك ، قم بإزالة غطاء اللوحة لمدة 3-6 ساعات لضمان الجفاف المناسب (إذا كان في بيئة معقمة).
   2. باستخدام علامة دائمة سميكة ، قم بعمل خط على الجانب السفلي من اللوحة على طول الحافة الخارجية وآخر لتشكيل حاجز منتصف الخط (الشكل 1). يجب أن يكون حاجز الخط الأوسط على مسافة متساوية من كل حافة من اللوحة. استخدم المسطرة لضمان قياسات دقيقة. ستكون هذه الخطوط بمثابة دليل عند نقل البكتيريا ومحلول النحاس. شريطة أن يتم نقل الإشريكية القولونية قبل محلول النحاس ، ستكون هذه الخطوط بمثابة مؤشرات.
   3. صفيحة البذور مع 50 ميكرولتر من OP50 بكتريا قولونية على جانب واحد فقط من الحاجز النحاسي لإنشاء عشب موحد (الشكل 2). يجب أن يظل تركيز البكتيريا ثابتا عبر المقايسات. ومع ذلك ، فقد لوحظ تباين طفيف استجابة لاختلافات طفيفة في التركيز.
      1. استخدم الخطوط المميزة على الجانب السفلي من اللوحة لضمان عدم ملامسة البكتيريا للمحلول النحاسي. شريطة أن يبطن المحلول النحاسي حافة الصفيحة ويشكل حاجزا في خط الوسط ، انقل البكتيريا حتى لا يتلامس محلول النحاس مع مصدر الغذاء.
   4. ضع علامة على مجموعة ثانية من الألواح ولا تنقل OP50 بكتريا قولونية إليها (الشكل 2). ستعمل هذه اللوحات على تقييم التحكم السلبي. يجب أن تحتوي هذه اللوحات أيضا على علامة على نصف اللوحة للإشارة إلى أصل النقل الأولي.
   5. اترك البكتيريا تجف ثم احتضن الأطباق عند 37 درجة مئوية طوال الليل. تأكد من عدم إزعاج البقع البكتيرية عند نقلها إلى حاضنة أو غرفة بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. يمكن أن يؤدي الاضطراب المفرط إلى تغيير موقع أو شكل رقعة الطعام.
3. فحص الانجذاب الكيميائي
   1. قم بإعداد محلول كبريتات النحاس (II) 0.5 متر حديثا قبل وقت بدء الفحص. شريطة استخدام 125 ميكرولتر من المحلول لكل لوحة ، قم بتوسيع نطاق هذا الحجم اعتمادا على عدد لوحات الفحص المستخدمة (على سبيل المثال 5 لوحات فحص ، 625 ميكرولتر).
   2. ماصة 100 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (II) على حافة الأجار لإنشاء حاجز نحاسي خارجي. يجب أن يكون الجانب السفلي الملحوظ من اللوحة بمثابة دليل.
   3. الماصة 25 ميكرولتر من محلول كبريتات النحاس (II) لإنشاء حاجز خط الوسط.
      1. تأكد من أن محلول كبريتات النحاس (II) لا يتلامس مع الرقعة البكتيرية. استخدم تقنية مرقطة لأن الخطوط قد تؤثر على الحركة بسبب المسافات البادئة / الخدوش على الأجار.
   4. اترك محلول النحاس يجف على الطبق. يمكن أن تختلف الفترة الزمنية حسب ظروف اللوحة والمختبر. تحقق بصريا من الجفاف كل 5 دقائق بعد النقل.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يعرض المحلول النحاسي لونا أزرق ويمكن التعرف عليه بسهولة. استخدم منديلا مختبرا لمسح المحلول برفق بالقرب من حافة اللوحة لتمييز الجفاف.
   5. الماصة 20 ميكرولتر من حبيبات الدودة من أسفل الأنبوب إلى النصف الخالي من البكتيريا من لوحة الفحص.
      1. تأكد من نقل 10 ديدان إلى لوحة الفحص. إذا تم تضمين ديدان إضافية عن طريق الخطأ ، فقم بإزالتها عن طريق قطفها بزيت الهالوكربون لضمان عدم إضافة أي بكتيريا إلى الطبق. يجب أن يحتوي كل اختبار على عدد ثابت من الديدان الخيطية أثناء الفحص.
         <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا تم نقل عدد قليل جدا من الديدان أثناء الفحوصات ، فإن زيادة حجم العينة الأولي ستخفف من الخسائر المحتملة أثناء الغسيل والنقل.
   6. قم بإزالة M9 الزائد من اللوحة بمنديل مختبر. يجب ألا يتلامس M9 مع محلول كبريتات النحاس (II).
      تحذير: تأكد من بقاء الديدان وسطح الأجار غير متأثرين أثناء تنفيذ هذه الخطوة. إذا تم استخدامها بقسوة شديدة ، يمكن لأنسجة المختبر أن تخلق فجوات على سطح أجار اللوحة ويمكنها إزالة الديدان. يجب التخلص من الديدان التي تمت إزالتها عن طريق الخطأ عبر KimWipe
   7. بمجرد إزالة محلول M9 وبدء جميع الديدان في أنماط الحركة غير السائلة ، ابدأ ساعة إيقاف الفحص.
      1. على النحو الأمثل ، قم بإزالة محلول M9 في غضون دقيقة. المعلمة الأساسية هي تحديد الحركة الجيبية. تتجول الديدان بشكل مختلف ، على سبيل المثال الضرب بدلا من الجيوب الأنفية ، عندما تكون سائلة. ابدأ ساعة إيقاف الفحص بمجرد توقف كل من الكائنات الحية التجريبية عن الضرب.
   8. افحص لوحات الفحص كل 30 دقيقة.
      1. بالنسبة للوحات الفحص ذات البقع البكتيرية ، قم بتسجيل الكائنات الحية بشكل إيجابي إذا وصلت إلى رقعة الطعام خلال فترة 4 ساعات. بالنسبة للوحات التحكم السلبية ، قم بتسجيل الكائنات الحية بشكل إيجابي إذا عبرت الحاجز.

النتائج

p class = "jove_content" fo: keep-together.within-page = "1" >
الشكل 1: تمثيل مرئي للعلامات للإشارة إلى وضع محلول النحاس على الجانب السفلي من طبق بتري 5 سم. تستخدم هذه المؤشرات للتأكد من أن أقسام اللوحة قد تم قياسها بشكل مناسب وتكون بمثابة مبدأ توجيهي عند نقل الرقعة البكتيرية ثم محلول النحاس إلى سطح الأجار.

الشكل 2: ينق...

المواد

<حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" نمط = "العرض: 929 بكسل ؛" العرض = "929"> قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات ارتفاع < ارتفاع TD = "58" النمط = "الارتفاع: 58 بكسل ؛ العرض: 373 بكسل ؛ "> محلول M9 [3 جم KH2PO4 ، 6 جم Na2HPO4 ، 5 جم كلوريد الصوديوم ، 1 مل 1 م MgSO4 ، H2O إلى 1 لتر. الأوتوكلاف للتعقيم قبل الاستخدام.] < نمط td = "العرض: 64 بكسل ؛ "> < نمط td = "العرض: 107 بكسل ؛ "> أنتجت في المختبر < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ ">كبريتات النحاسية سيغما سي -1297 استخدم الماء للتعليق بشكل مناسب إلى تركيز 0.5 متر