C. ايليجانس قياسات منطقة العضلات: طريقة موحدة لتحديد مورفولوجيا العضلات المخططة

الملخص

المصدر: Teoh ، J. S. et al. الأساليب الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا العضيات في Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp.(2019).

C. ايليجانس لها نوعان من العضلات ، قسيم عضلي واحد وعضلي عضلي متعدد ، أو عضلات مخططة. يصف هذا الفيديو ترتيب عضلات جدار الجسم المخططة ، المسؤولة عن حركة الدودة ويتضمن عينة من بروتوكول لقياس مورفولوجيا العضلات باستخدام برنامج تحليل الصور.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتبس من Teoh et al ، الأساليب الكمية لدراسة الهياكل الخلوية ومورفولوجيا العضيات في Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2019).

فئة < p = "jove_title" >1. قياس بنية عضلات جدار الجسم

1. التصوير الفلوري لهيكل عضلات جدار الجسم
   1. احصل على سلالة (على سبيل المثال ، RW1596) تحمل الجينات المعدلة stEx30 (Pmyo-3 :: gfp :: myo-3 + rol-6 (su1006)) ، والتي تصنف ألياف الميوسين ب GFP.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن تحقيق إدخال الجين المعدل في إما عن طريق عبور سلالة ذات أهمية مع التي تعبر بالفعل عن الجين المعدل ، أو حقن الحمض النووي الدقيق في الذراع البعيدة للغدد التناسلية. يسهل النمط الظاهري "المتدحرج" الناجم عن طفرة رول 6 في هذا الجين المعدل تصور العضلات. تمتد عضلات جدار الجسم على طول الجانبين الظهري والبطني الذي عادة ما يتم منعه من الأنظار في البرية لأنها عادة ما تقع على أحد جوانبها الجانبية. يحفز أليل rol-6 (su1006) التواء ، وبالتالي يعرض بعض خلايا العضلات للتصوير.
   2. قم بتصوير باستخدام مجهر مضان مقترنا بكاميرا جهاز مقترنة مشحونة عالية الدقة (CCD) ، موضوعي 40X أو أعلى ، مرشح GFP وبرنامج اكتساب.
   3. اضبط وقت التعريض الضوئي وشدة الإضاءة لمنع الصور المشبعة.
   4. التقط صورا للعضلات (تكبير 400X) واحفظها من قسم من يحتوي على خلية عضلية مائلة مرئية واحدة على الأقل. تجنب المناطق التي تحتوي على خلية عضلية واحدة غير مكتملة أو أقسام خارج نطاق التركيز. استبعد أيضا الصور من المناطق الأمامية والخلفية القصوى والمناطق المجاورة للفرج.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: إذا لم يكن لدى خلية عضلية كاملة مرئية واحدة ، فقم بتحريك الغطاء برفق لقلب لكشف خلية كاملة.
2. قياس مساحة الخلايا العضلية
   1. افتح الصورة في برنامج فيجي (تم استخدام الإصدار 2.0.0 في هذه الدراسة).
   2. استخدم اختيار المضلع للتتبع بعناية حول خلية عضلية مائلة واحدة. اضبط خط المضلع في النهاية عن طريق سحب نقطة الارتساء لتحسين التتبع.
   3. انتقل إلى علامة التبويب "تحليل" في الجزء العلوي من البرنامج وانقر فوق "قياس" لحساب مساحة التحديد. سيظهر جدول نتائج منفصل يحتوي على المنطقة والقياسات الأخرى. إذا كان قياس المساحة مفقودا من جدول النتائج، فانتقل إلى تعيين القياسات ضمن علامة التبويب تحليل وتحقق من تحديد مربع المنطقة. وبالمثل ، قم بإلغاء تحديد القياسات الأخرى غير المطلوبة.
   4. بالنسبة لخلايا العضلات ذات المنطقة المتدهورة/المفقودة، تتبع المنطقة المفقودة باستخدام أداة تحديد المضلع وانقر فوق قياس مرة أخرى. إذا كانت هناك فجوات متعددة داخل الخلية ، فتتبع كل فجوة على حدة.
   5. احسب نسبة مساحة الفجوة إلى الخلية العضلية المفردة بأكملها. تشير النسبة العالية إلى مدى أعلى من تنكس العضلات بسبب الفجوات الكبيرة داخل الخلية. إذا لم تكن هناك مناطق مفقودة ، كما هو شائع في البرية ، حساب النسبة على أنها صفر.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: كعنصر تحكم ، سجل أيضا عيوب بنية العضلات بصريا وقارن النتائج بالقياس الكمي. هذا مفيد بشكل خاص إذا كانت السلالة قيد الدراسة لأول مرة في المختبر. بالنسبة لتسجيل النمط الظاهري ، قم بتقييم على أنها معيبة أو غير معيبة بناء على سلامة الخيوط. على سبيل المثال ، سيتم تصنيف التي تفقد خطوط خيوط مميزة ، أو تكتل GFP ، أو فجوات داخل خلايا العضلات بسبب الانهيار الهيكلي ، على أنها معيبة.

المواد