هذا البروتوكول مقتطف من Xu and Chisholm ، طرق جرح الجلد ومقايسات استجابات الجروح في C. ايليجانس، J. Vis. Exp. (2014).
فئة < ص = "jove_title" >
1. الجرح بالليزر
< فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: استخدم تشعيع ليزر الفيمتو ثانية (800 نانومتر) لإجراء جرح أكثر دقة.
- قم بإعداد وسادات أجار على شريحة زجاجية مع أجار ذائب بنسبة 2٪. تأكد من أن الوسادات مشابهة لضمادات الأجار المستخدمة في التصوير المباشر ل C. ايليجانس.
- انقل 10 ديدان صغيرة إلى وسادة الاغاروز باستخدام معول دودة ، وأضف قطرة 2 ميكرولتر من محلول 12 ملي مولار من الليفاميزول. قم بتغطية والسائل بقلة غطاء. انتظر 1-2 دقيقة حتى تشل الديدان.
- ضع الشريحة الزجاجية على مجهر متحد البؤر للقرص الدوار. حرك المرحلة للعثور على الديدان وركز على البشرة المخلوية الأمامية أو الخلفية الجانبية بهدف 100X (NA 1.4-1.46).
- اضبط قوة ليزر الفيمتو ثانية على 140 ميجاوات (تقاس قبل الهدف). استخدم ليزر الفيمتو ثانية بمعدل تكرار 80 ميجاهرتز.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: نبضتان سعة كل منهما 200 مللي ثانية (مفصولة ب 20 مللي ثانية) تكفيان للجرح في أيدينا.
- ركز على السطح القمي لخلية البشرة وجرح البشرة. لاحظ الاضطراب الموضعي للسيتوبلازم (الفقاعات) ، أو التبييض الموضعي لأي علامة فلورية مستخدمة.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: اتبع إجراءات السلامة المناسبة بالليزر عند استخدام ليزر الفيمتو ثانية. يجب أن توفر عمليات المسح الخطي أو النقطي باستخدام ليزر الفيمتو ثانية مثل تلك الموجودة في مجههر الفوتون طاقة كافية للجرح بالليزر.
<فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: على الرغم من أننا لا نملك خبرة مباشرة في استخدام أشعة الليزر الأخرى ، فمن حيث المبدأ يجب أن يكون الجرح ممكنا باستخدام ليزر الأشعة فوق البنفسجية التقليدي (كما هو مستخدم في C. ايليجانس استئصال الخلايا). اختياريا ، استخدم وحدة استعادة التألق بعد التبييض الضوئي (FRAP) على قرص الغزل متحد البؤر لجرح البشرة (N. Pujol ، الاتصال الشخصي).
