تغذية FITC-Dextran: طريقة لتحديد نفاذية الأمعاء في C. ايليجانس

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Le, T. A. N. وآخرون. قياس تأثير البكتيريا والمواد الكيميائية على نفاذية الأمعاء ل Caenorhabditis elegans.J. Vis. Exp. (2019).

يقدم هذا الفيديو طريقة لتصور وقياس سلامة C. ايليجانس تجويف الأمعاء عن طريق تغذية الديدان المسمى ديكستران FITC. يوضح بروتوكول المثال الفحص الذي تم إجراؤه باستخدام 3،3'-diindolylmethane (DIM) المعالجة والديدان التي تتغذى على مسببات الأمراض.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Le et al ، قياس تأثيرات البكتيريا والمواد الكيميائية على نفاذية الأمعاء ل Caenorhabditis elegans، J. Vis. Exp. (2019).

1. تحضير ألواح NGM لاختبار تأثيرات مادة كيميائية (DIM) على نفاذية الأمعاء ل C. ايليجانس التي تغذى بالمتصورة الزنجارية
   1. أضف 0.5 جم من البيبتون ، و 0.6 جم من كلوريد الصوديوم ، و 195 مل من الماء المقطر ، ومحرك مغناطيسي ، و 6.8 جم من أجار إلى زجاجة زجاجية سعة 500 مل (NGM agar).
   2. أضف 0.5 غرام من البيبتون ، و 0.6 غرام من كلوريد الصوديوم ، و 195 مل من الماء المقطر ، ومحرك مغناطيسي بدون أجار إلى زجاجة زجاجية أخرى سعة 500 مل (مرق NGM).
   قم
   3. بتعقيم الزجاجتين (من الخطوات من 1.1 إلى 1.2) ، وزجاجة زجاجية فارغة سعة 100 مل ، وزجاجة زجاجية فارغة سعة 500 مل لمدة 15 دقيقة عند 121 درجة مئوية. بعد ذلك ، اترك الزجاجات التي تحتوي على الوسط لتبرد إلى 55 درجة مئوية في الحمام المائي لمدة 30 دقيقة. احتفظ بوسط الأجار في الحمام المائي وقم بإزالة الزجاجة التي تحتوي على المرق (من الخطوة 1.2) للخطوة التالية.
   4. أضف المواد الكيميائية المضافة إلى مرق NGM: 0.4 مل من 1 M CaCl₂ ، 0.4 مل من الكوليسترول في الإيثانول (مل) ، 0.4 مل من 1 M MgSO₄ و 10 مل من 1 M KPO₄ (يجب تعقيم كل هذه المكونات بصرف النظر عن الكوليسترول الموجود في الإيثانول). ثم حرك الخليط جيدا باستخدام محرك مغناطيسي عند 55 درجة مئوية.
   5. قم بتسمية الزجاجة الفارغة المعقمة سعة 500 مل بثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) والزجاجة الزجاجية الفارغة سعة 100 مل المعقمة ب DIM.
   6. انقل 50 مل من مرق NGM إلى زجاجة 100 مل تحمل علامة DIM. أضف 500 ميكرولتر من 20 ملم من مرق DIM في الزجاجة واخلطه جيدا.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يتم إذابة DIM في DMSO (مخزون DIM 20 ملي).
   7. قم بإزالة وسط أجار NGM بسرعة من الحمام المائي ، وأضف 50 مل من وسط أجار NGM إلى الزجاجة التي تحمل علامة DIM واخلطها جيدا.
   8. ضع كمية 20 مل من وسط NGM المحتوي على DIM في كل طبق بتري مقاس 90 مم × 15 مم. يمكن صنع ما يقرب من خمس لوحات NGM تحتوي على DIM من هذه الخطوة.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: سيكون التركيز النهائي ل DIM في كل لوحة NGM 100 ميكرومتر.
   9. لتحضير لوحة NGM المحتوية على DMSO ، انقل 150 مل من مرق NGM إلى زجاجة 500 مل تحمل علامة DMSO. أضف 1.5 مل من DMSO إلى الزجاجة واخلط جيدا.
   10. أضف 150 مل من وسط NGM agar إلى الزجاجة التي تحمل علامة DMSO واخلطها جيدا.
   11. ضع كمية 20 مل من وسط NGM المحتوي على DMSO في كل طبق بتري 90 مم × 15 مم. يمكن صنع ما يقرب من خمسة عشر لوحة NGM تحتوي على DMSO من هذه الخطوة.
       <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: سيكون التركيز النهائي ل DMSO في كل لوحة NGM 0.5٪.
   12. قم بترسيخ الألواح في درجة حرارة الغرفة لمدة 3 ساعات على الأقل وقم بتخزينها في درجة حرارة 4 درجات مئوية حتى الاستخدام.
       NOTE: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
   13. قم بإزالة الإشريكية القولونية OP50 أو P. aeruginosa مزرعة PAO1 من الثلاجة 4 درجات مئوية وقم بتدوير المزرعة بشكل صحيح قبل نشرها على ألواح NGM.
   14. ضع 800 ميكرولتر من الإشريكية القولونية OP50 أو P. aeruginosa PAO1 المزرعة البكتيرية على كل صفيحة أجار NGM جديدة واترك الألواح تجف في حاضنة 20 درجة مئوية طوال الليل.
       NOTE: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا. بالنسبة للتجربة الثالثة (الشكل 1) ، تم إعداد لوحين NGM المحتويين على DMSO مغطى ب E. coli OP50 الحي ، ولوحة NGM واحدة تحتوي على DMSO مطلية ب P. aeruginosa PAO1 الحي ، ولوحة NGM واحدة تحتوي على DIM مطلية ب P. aeruginosa PAO1
   الحية.
2. علاج البكتيريا أو تغذية DIM و FITC-dextran.
   1. احتضان البويضات المتزامنة مع العمر عند 20 درجة مئوية لمدة 64 ساعة على أطباق NGM المكملة بالإشريكية القولونية الحية OP50 كغذاء.
   2. اغسل يرقة L4 المتزامنة مع العمر باستخدام S-buffer وانقلها (أكثر من 500 دودة تقريبا) إلى ألواح المعالجة NGM التي تحتوي على بكتيريا ومواد كيميائية مختلفة. احتضنها عند 20 درجة مئوية لمدة 48 ساعة < / > <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن أن يتراوح وقت العلاج من 24 إلى 72 ساعة ، وفقا للبكتيريا والمواد الكيميائية المستخدمة. يمكن أيضا تقييم التأثير العلاجي أو الوقائي لخافت عن طريق المعالجة المسبقة للديدان بمسببات الأمراض ومن ثم علاج الديدان مع خافت (التأثير العلاجي) أو عن طريق المعالجة المسبقة للديدان مع خافت ومن ثم العلاج بمسببات الأمراض (التأثير الوقائي).
   3. لتحضير الأطباق المكملة ب FITC-dextran ، اخلطي 2 مل من الإشريكية القولونية OP50 المعطلة بالحرارة مع 4 ملغ من FITC-dextran. بعد ذلك ، قسم 100 ميكرولتر من خليط FITC-dextran و E. coli OP50 إلى عشرين صفيحة أجار NGM جديدة (60 مم × 15 مم) واترك الألواح تجف لمدة 1 ساعة على مقعد نظيف><. <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: سيكون التركيز النهائي ل FITC-dextran في كل لوحة NGM 20 ميكروغرام / مل.
   4. قم بإعداد خمس ألواح NGM تحتوي على الإشريكية القولونية OP50 بدون FITC-dextran لمعالجة التحكم في السيارة. لهذا الغرض ، قسم 100 ميكرولتر من الإشريكية القولونية OP50 المعطلة بالحرارة إلى كل ألواح أجار NGM جديدة (60 مم × 15 مم) واترك الألواح تجف لمدة ساعة واحدة على مقعد نظيف><. <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لكل تجربة مستقلة ، يلزم وجود خمسة عشر لوحة NGM مكملة ب FITC-dextran وخمس لوحات NGM بدون FITC-dextran.
   5. بعد 48 ساعة من العلاج (من الخطوة 2.2) ، اغسل الديدان باستخدام S-buffer ، وانقل الديدان إلى الألواح المكملة ب FITC-dextran وألواح NGM بدون FITC-dextran ، واحتضان الألواح طوال الليل (14-15 ساعة).
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: لكل مجموعة علاج ، يلزم وجود 5 تكرارات من تلطيخ FITC-dextern (أو تغذية التحكم في السيارة).
   6. اغسل الديدان باستخدام S-buffer واتركها بالزحف في لوحة أجار NGM الطازجة لمدة 1 ساعة < / > <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: لكل تجربة مستقلة ، هناك حاجة إلى ما مجموعه 20 لوحة NGM جديدة. في هذه الخطوة ، يمكنك استخدام لوحة NGM المكملة بدون أو مع الإشريكية القولونية OP50.
   7. أضف 50 ميكرولتر من محلول الفورمالديهايد بنسبة 4٪ إلى كل بئر من صفيحة سوداء ذات قاع مسطح 96 بئرا. انقل ما يقرب من 50 دودة من كل صفيحة NGM إلى كل بئر لقياسات التألق. بعد 1 إلى 2 دقيقة ، قم بإزالة كل الفورمالديهايد جيدا من كل بئر وأضف 100 ميكرولتر من وسط التركيب لتغطية الآبار.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: يستخدم محلول الفورمالديهايد (4٪) لشل حركة الديدان وإصلاحها. لكل مجموعة معالجة ، يتم استخدام 5 آبار (5 مكررات) لتحليل الصور.
3. تصوير C. ايليجانس باستخدام نظام تصوير الأوبريت وتحديد نفاذية الأمعاء عن طريق قياس امتصاص FITC-dextran
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة:يمكن استخدام المجهر المجهري الفلوري لتحليل الصور بدلا من نظام الأوبريتا.
   1. التقط صورا مضتة وقم بقياس شدة التألق باستخدام نظام التصوير عالي المحتوى Operetta وتحليل الصور باستخدام برنامج Harmony.
   2. في برنامج Harmony ، اضغط على أيقونة افتح الغطاء لفتح الغطاء ووضع اللوحة في الجهاز.
   3. قم بإعداد المعلمات.
   4. انقر فوق إعداد، وحدد نوع اللوحة (96 بئرا من القرصة المسطحة) وأضف القنوات (قنوات المجال الساطع وقنوات EGFP).
   5. اضبط التخطيط. انتقل إلى تحديد التخطيط ، ثم حدد تتبع واضبط المعلمات (الصورة الأولى عند 1 ميكرومتر ، عدد المستويات 10 ، المسافة 1 ميكرومتر).
   6. حدد أحد آبار المعالجة وحقل التقاط واحد واضغط على اختبار للتحقق مما إذا كانت الصور مرضية في قسم تشغيل التجربة.
   7. إذا كانت الصور مرضية ، فارجع إلى قسم الإعداد واضغط على أيقونة إعادة تعيين في نهاية الشاشة. ثم حدد جميع الآبار المستهدفة وعددا مناسبا من حقول الالتقاط.
   8. انتقل إلى تشغيل التجربة مرة أخرى وأدخل اسم اللوحة، ثم اضغط على ابدأ لبدء المعالجة.
   9. لقياس شدة التألق ، انتقل إلى قسم تحليل الصور وأدخل الصورة. ابحث عن الخلية عن طريق اختيار قناة EGFP والطريقة B. اضبط العتبة المشتركة إلى 0.5 ، والمساحة إلى >200 ميكرومتر² ، وعامل الانقسام إلى 3.0 ، والعتبة الفردية إلى 0.18 والتباين إلى أكثر من 0.18. ثم احسب خصائص الشدة واختر المتوسط كناتج. اضغط على أيقونة تطبيق لحفظ الإعداد.
   10. انتقل إلى قسم التقييم لقياس الشدة من خلال الحصول على خريطة تمثيلية وجدول بيانات. قم بتعيين معلمة القراءة إلى الخلايا - متوسط كثافة الخلية EGFP - المتوسط لكل بئر وابدأ التقييم.
       NOTE: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
   11. لاستخراج البيانات من Operetta ، انقر فوق الزر "إعداد" واختر إدارة البيانات.
   12. اختر كتابة الأرشيف، ثم افتح الاستعراض وحدد الملف.
   13. لتحديد الملف، انقر فوق إشارة + الصغيرة في الزاوية اليسرى، ثم انقر فوق قياس واختر اسم اللوحة.
   14. حدد الملف وانقر فوق موافق.
   15. حدد المسار لحفظ الملف بالنقر فوق إشارة الاستعراض في المسار النشط.
   16. انقر فوق ابدأ لحفظ ملف البيانات.
       NOTE: يمكن إيقاف البروتوكول مؤقتا هنا.
4. التحليل الإحصائي لمضان FITC-dextران ل C. ايليجانس
   1. استيراد البيانات وحساب المتوسط والانحراف المعياري (SD) باستخدام برنامج إحصائي.
   2. تحليل الفرق المعتد به من خلال تحليل التباين أحادي الاتجاه (ANOVA) متبوعا باختبار المقارنة المتعددة ل Tukey.

النتائج

الشكل 1: تأثير خافت على نفاذية الأمعاء ل C. ايليجانس تغذى على P. aeruginosa.صور مجهرية للديدان من (أ) بكتريا قولونية OP50 بدون تغذية FITC-dextran ، (B) بكتريا قولونية مع تغذية FITC-dextran ، (C) P. aeruginosa PAO1 مع تغذية FITC-dextran، و (

المواد

قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < TD >3،3'-diindolylmethane < td > سيجما < تي دي >D9568 < تي دي > أطباق بتري < >90×15 مم SPL علوم الحياة ، كوريا الجنوبية 10090 < td > باكتر أجار بيكتون ديكنسون الرقم المرجعي 214010 محلول الفورمالديهايد سيغما F1635 < td >Caenorhabditis elegans N2 مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) النوع البري < td > الكوليسترول سيغما سي 3045 لوحة فحص كوستا ، 96 بئر أسود مع قاع مسطح شفاف غير معالج ، بدون غطاء بوليسترين كورنينج إنكوربوريتد المرجع 3631 < td > ثنائي ميثيل سلفوكسيد سيغما د2650 < تي دي >الإشريكية القولونية OP50 مركز علم الوراثة Caenorhabditis (CGC) فلورسين إيزوثيوسيانات - ديكستران سيغما FD10S برنامج Harmony بيركين إلمر فيرسون 3.5 كبريتات المغنيسيوم سباعي الهيدرات كواشف فيشر الحيوية ص2213-1 < td > Fluoromount وسط تركيب مائي سيغما F4680 < td > نظام تحليل المحتوى العالي Operetta CLS بيركين إلمر HH16000000 < td > الببتون ميرك EMD 1.07213.1000 Pseudomonas aeruginosa PA01 مجموعة كورية لثقافة النوع رقم KCTC 1637 < td > كلوريد الصوديوم كواشف فيشر الحيوية ص ب 358-1 < td > مجهر ستيريو نيكون، اليابان SMZ800N