حقن الغدد التناسلية المجهرية: طريقة لتوصيل المركب مباشرة إلى السلالة الجرثومية ل C. ايليجانس

الملخص

المصدر: Farboud ، B. et al ، تحرير الجينوم المحسن باستخدام البروتين النووي الريبي Cas9 في الخلايا والكائنات الحية المتنوعة.J. Vis. Exp. (2018).

يصف هذا الفيديو الحقن المجهري ، وهي طريقة شائعة لإنشاء سلالات C. ايليجانس المعدلة وراثيا. في المثال ، سنرى الحقن المجهري يستخدم لإدخال مركب البروتين النووي الريبي (RNP) لتحرير الجينات في قواعد كريسبر.

البروتوكول

البروتوكول التالي هو مقتطف من Farboud et al ، Enhanced Genome Editing باستخدام Cas9 ribonucleoprotein in Diverse Cells and Organisms ، J. Vis. Exp.(2018).

< p class = "jove_title" >1. تجميع RNP

1. صمم التجربة في وقت مبكر ، واحصل على جميع مكونات الحمض النووي الريبي والحمض النووي والبروتين في وقت مبكر. كتمريرة أولى ، جرب أحد الضوابط الإيجابية المدرجة في الجدول 1 واستخدم الكواشف التجارية الموضحة في جدول المواد لضمان تصميم تجريبي موثوق به وسلامة المواد. للحصول على نصائح إضافية حول التخطيط لتجربة جديدة لتحرير الجينوم ، راجع الأوراق حول هذا الموضوع.< / > <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: بمجرد تجميعها كما هو موضح في الخطوات اللاحقة ، يمكن تخزين RNPs المعدة مسبقا عند -80 درجة مئوية.
   1. بعد اختيار الجين الذي يجب استهدافه ، استخدم إحدى الأدوات المجانية عبر الإنترنت لتصميم gRNA الأمثل. تأكد من استهداف exon إذا كنت تأمل في إنشاء ضربة قاضية.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: ستساعد هذه الأدوات في تحديد موقع مستهدف بتسلسل PAM مجاور ، ودرجة عالية الجودة ، ودرجة منخفضة خارج الهدف.
   2. قم بتنقية بروتين S. pyogenes Cas9 من خلال الطرق المنشورة أو شرائه من بائع تجاري.
   3. قم بإعداد مخزن مؤقت نموذجي ل Cas9 لتخفيف الحمض النووي الريبي ، وتحضير RNP ، وتخزين البروتين ، والذي يحتوي على 20 ملي مولار من درجة الحموضة HEPES 7.5 ، و 150 ملي مولار من KCl ، و 10٪ جلسرين ، و 1 ملي مولار من TCEP. استخدم دائما الماء الخالي من النوكلياز في المخازن المؤقتة التي سيتم استخدامها لتعليق أو تخفيف الحمض النووي الريبي لمنع التدهور.
   4. قم بإنتاج دليل الحمض النووي الريبي (tracrRNA و crRNA أو sgRNA) من خلال النسخ في المختبر باستخدام الطرق المنشورة ، أو شرائه من شركة تخليق الحمض النووي.
   5. في حالة إدخال جين ، قم بتصنيع أو شراء قالب الحمض النووي للمتبرع.
   6. قم بتخزين البروتين وحصص الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية وقم بإذابة الثلج على الثلج مباشرة قبل الاستخدام.
      <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: كل تجميد ذوبان يقلل قليلا من الكفاءة. تتوفر بروتوكولات مفصلة مفتوحة الوصول لتنقية Cas9 والنسخ المختبري ل sgRNAs في مكان آخر.
2. إعداد RNP ل C. ايليجانس التحرير: قم بتجميع مركب RNP عن طريق إضافة الكواشف التالية من أجل إنشاء حجم نهائي يبلغ 20 ميكرولتر (يتم ملاحظة التركيزات النهائية بين قوسين): Cas9 (2 ميكرومتر) ، HEPES الرقم الهيدروجيني 7.5 (10 ميكرومتر) ، KCl (115 ميكرومتر) ، crRNA (12 ميكرومتر) ، tracrRNA (40 ميكرومتر) ، وقوالب الإصلاح إذا لزم الأمر (0.5 ميكرومتر ssDNA أو ما يصل إلى 350 نانوغرام / ميكرولتر dsDNA).< / > <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: تتناسب كفاءة إصلاح DSB بوساطة Cas9 مع تركيز بنية إصلاح dsDNA. وبالتالي ، كلما زاد تركيز قالب الإصلاح ، زادت كفاءة الإصلاح النموذجي. ومع ذلك ، فقد ثبت أن حقن الخلطات التي تحتوي على أكثر من 350 نانوغرام / ميكرولتر من dsDNA يقلل من صلاحية الديدان المحقونة. وبالتالي ، من الأفضل استخدام ما يصل إلى 350 نانوغرام / ميكرولتر من dsDNA في المزيج لزيادة كفاءة الإصلاح مع تقليل قدرته على الفتك.
   1. أضف العديد من crRNAs لاستهداف مواقع متعددة في وقت واحد ، حسب الحاجة لنهج فحص التحويل المشترك / التحويل المشترك. عند إضافة أكثر من crRNA واحد ، أضف كل منها بالتتابع إلى المزيج الرئيسي.
      <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: لا يلزم أن تكون كمية كل crRNA هي نفسها ، وحتى مضاعفة التركيز الكلي ل crRNAs في المزيج الرئيسي دون تغيير تركيز Cas9 لا يبدو أنه يتداخل مع تواتر الطفرات في موضع معين. تم وصف الأمثلة بالتفصيل في Paix et al.
   2. امزج عن طريق سحب العينات وقم بتدوير محلول RNP عند 16,000 × جم لمدة 5 ثوان لضمان تجميع المحلول في قاع الأنبوب.
   3. احتضان المحلول عند 37 درجة مئوية لمدة 15 مترا.
   4. الطرد المركزي العينة عند 16,000 × جم لمدة 1 دقيقة لتكسير أي جسيمات يمكن أن تسد إبرة الحقن المجهري رقيقة المملة. استخدم المادة الطافية في الخطوات اللاحقة.
3. C. تحضير ايليجانس

< p style="الهامش الأيسر:.5in;">1. 1 يوم قبل الحقن المجهري: تحضير ضمادات الاغاروز للحقن المجهري.

1. اصنع محلول أغاروز بنسبة 3٪ (وزن / حجم) في الماء عن طريق إضافة الاغاروز إلى الماء وغلي المحلول على طبق ساخن أو في الميكروويف.
2. رتب شرائح زجاجية مقاس 24 مم × 50 مم × 1.5 مم على طاولة واستخدم ماصة باستور زجاجية لوضع قطرة صغيرة (~ 15 ميكرولتر) من محلول الاغاروز على الشريحة. قم بتسطيح قطرة الاغاروز بسرعة عن طريق وضع غطاء آخر في الأعلى. اترك الاغاروز يتصلب ثم قم بإزالة أحد الغطاء.
3. اترك الغطاء المغطى بالأغروز ووجهه لأعلى على سطح الطاولة طوال الليل حتى يجف. بعد 24 ساعة ، قم بتخزين ضمادات الاغاروز في وعاء نظيف وجاف.
   <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن استخدامها إلى أجل غير مسمى.

2. اسحب إبر الحقن المجهري: باستخدام الشعيرات الدموية الزجاجية البورسليكات مع خيوط (القطر الخارجي 1.0 مم والقطر الداخلي 0.58 مم) ، اسحب الإبر بناء على Mello و Fire⁵⁷ وموارد أخرى. يمكن استخدام الإبر على الفور أو يمكن تخزينها في حاوية نظيفة وجافة ، مدعومة بدعامات من الطين.

3. للحفاظ على الديدان، قم بإعداد أجار وسائط نمو الديدان الخيطية (NGM) المصبوبة في ألواح بتري ورصدها ببكتيريا OP50 (للحصول على بروتوكولات على صيانة C. ايليجانس القياسية ووصفات وسائط النمو، انظر Stiernagle).

4. قم بوضع الديدان للحقن المجهري: قبل 12-24 ساعة من الحقن المجهري، اختر الخنثى ذات المراحل L4 إلى صفيحة NG-agar جديدة مع بكتيريا OP50 واحتضانها طوال الليل عند 20 درجة مئوية. لكل مزيج هدف / حقن Cas9 ، اختر ~ 30 دودة على اللوحة.

4. يوم الحقن المجهري: قم بتحميل إبرة الحقن المجهري المسحوبة بمحلول RNP الطافي المحضر في الخطوة 1.2.
   1. ماصة المادة الطافية من الخطوة 1.2.4 إلى ماصة شعرية مسحوبة وردم المحلول من الماصة الشعرية إلى إبرة الحقن المجهري المحضرة (تحميل أقل من 0.1 ميكرولتر بشكل عام).
5. قم بتركيب الإبرة المحملة على جهاز الحقن الدقيق المتصل بمعالج دقيق. اضبط ضغط جهاز الحقن على 250 كيلو باسكال وضغط التوازن على 25 كيلو باسكال.
6. قم بكسر طرف الإبرة المحمل لإنشاء حافة إبرة حادة. ضع غطاء مربع مقاس 15 مم × 15 مم × 1.5 مم أعلى غطاء مقاس 24 مم × 50 مم × 1.5 مم.
   1. تراكب حافة واحدة من الغطاء المربع بزيت الهالوكربون 700.
   2. ضع الإبرة في الزيت ، على حافة الغطاء المربع 15 مم.
   3. باستخدام يد لتوجيه مرحلة المجهر والغطاء ، قم بتنظيف الشريحة لأعلى وعلى طول حافة الإبرة أثناء الضغط على دواسة / زر الحقن. كسر طرف الإبرة للخلف ، مما يزيد من تدفق السائل خارج الإبرة. حقق معدل التدفق الأمثل عن طريق جعل مزيج الحقن يتدفق لأعلى على طول حافة الإبرة ، وتشكيل ~ 1 فقاعة / ثانية.
7. تأكد من أن ديدان L4 التي تم اختيارها قبل 12-24 ساعة من الحقن المجهري هي شباب من المراحل التنموية في يوم الحقن. اختر الديدان الصغيرة إلى صفيحة NG-agar التي تفتقر إلى بكتيريا OP50 واسمح لها بالزحف لمدة 5 دقائق. هذا يقلل من كمية البكتيريا المنقولة إلى وسادة الحقن ، مما يقلل من انسداد الإبرة.
8. ضع وسادة حقن الاغاروز / غطاء على نطاق التشريح. باستخدام معول دودة ، ضع مسارا صغيرا من زيت الهالوكربون على طول حافة واحدة من الوسادة.
9. باستخدام معول الدودة المطلي بالزيت ، ارفع عدة ديدان من لوحة NG-agar إلى مسار الزيت. مع وجود شعر ناعم متصل بماصة ، مثل رمش أو شعيرات قطة ، ضع الديدان بالتوازي ، وادفع الديدان برفق إلى وسادة الاغاروز. حتى تشعر بالراحة مع إجراء الحقن المجهري ، قم بتركيب وحقن دودة واحدة فقط في كل مرة.< / > <فئة قوية = "ملاحظة" >ملاحظة: سوف يمتص الاغاروز الجاف الرطوبة من الديدان ، مما يجعلها تلتصق بالوسادة. وبالتالي ، يجب على المرء أن يعمل بسرعة حيث يمكن للديدان أن تجف.
   1. بمجرد وضعها في موضعها وتوصيلها بالوسادة ، قم بتراكب الديدان ببضع قطرات أخرى من زيت الهالوكربون (~ 20 ميكرولتر) من طرف معول الدودة.
10. C. ايليجانس الحقن المجهري الغدد التناسلية مع RNPs ورعاية ما بعد الحقن
    تم اقتباس بروتوكول الحقن المجهري من Mello و Fire ويتم وصفه بالتفصيل في مكان آخر.
    1. ضع الغطاء مع الديدان المثبتة على مجهر الحقن. تحت تكبير منخفض (هدف 5X ، 10X عيني) ، ضع الديدان بشكل عمودي على إبرة الحقن.
       1. قم بالتبديل إلى تكبير عال (هدف 40X ، 10X عيني) ، وأعد وضع الإبرة المجاورة لذراع الغدد التناسلية المقابلة للمنطقة القريبة من النوى في منتصف إلى أواخر الباشيتين.
       2. باستخدام المعالج الدقيق ، حرك الإبرة ضد الدودة ، واضغط على البشرة قليلا. ثم ، بيد واحدة ، اضغط على جانب مرحلة المجهر لتحريك الإبرة عبر البشرة. اضغط على دواسة / زر الحقن واملأ ذراع الغدد التناسلية ببطء بمزيج الحقن وقم بإزالة الإبرة.
       3. كرر هذه الخطوة مع ذراع الغدد التناسلية الأخرى.
    2. بمجرد حقن الديدان ، قم بإزالة وسادة الغطاء / الاغاروز وضعها تحت مجهر تشريح.
       1. باستخدام ماصة شعرية مسحوبة، قم بإزاحة الزيت من الديدان عن طريق سحب عازلة M9 فوقها. قم بإجراء هذا العلاج لتحرير الديدان من الأجار.
       2. بعد 10 دقائق ، عندما تضرب الديدان في المخزن المؤقت ، انقلها إلى صفيحة NG-agar مع بكتيريا OP50 باستخدام الماصة الشعرية المسحوبة. ضع اللوحة على حرارة 20 درجة مئوية لمدة 2-3 ساعات حتى تتعافى الديدان وتتحرك.
    3. بمجرد التعافي ، انقل الديدان بشكل فردي إلى ألواح NG-agar مع OP50 ونقل الألواح إلى حاضنة 25 درجة مئوية.
    4. اسمح للديدان المحقونة P 0 بالنمو ووضع ذرية لمدة 3 أيام. فحص نسل F₁.
       1. إذا كنت تستخدم مشترك كريسبر أو التحويل المشترك ، فحدد الديدان المرشحة للفحص بناء على ما إذا كان لديها النمط الظاهري المتحور للجين المرجعي. انقل هذه الديدان المميزة بشكل فردي إلى ألواح NG-agar جديدة مع OP50 واسمح لها بوضع ذرية F₂ عند 20 درجة مئوية
          <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يجب أن يوفر النمط الظاهري المستخدم لفحص أو اختيار CO-CRISPR تقديرا مبكرا لنجاح تحرير Cas9.
       2. في حالة عدم وجود النمط الظاهري المشترك CRISPR ، قم بحقن بلازميد تحكم إيجابي للمساعدة في تحسين كفاءة الحقن المجهري.
          <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: على سبيل المثال ، سيساعد تضمين البلازميد في مزيج الحقن الذي يشفر MYO-2 الموسوم ب mCherry في تقييم كفاءة الحقن. الديدان التي تم حقنها بنجاح باستخدام pCFJ90 سيكون لها بعض النسل مع البلعوم الفلوري.
    5. افحص الديدان F₁ لمعرفة وجود التعديلات المطلوبة. اختر الأم F₁ إلى بئر فردي من صفيحة مكونة من 96 بئرا ، وقم بتحريضها ، وافحص الحمض النووي الخاص بها إما عن طريق تضخيم تفاعل البوليميراز المتسلسل الخاص بالإدخال ، أو تحليل تسلسل الحمض النووي ، أو مقايسة نوكلياز المساح (CEL-1).
       <فئة قوية = "ملاحظة">ملاحظة: يمكن إجراء هذه المقايسات عند استخدام التحويل المشترك / التحويل المشترك أو أنظمة الفحص أو الاختيار الأخرى.

النتائج

الجدول 1: الضوابط الإيجابية لتجارب تحرير الجينوم الأولية.يوضح هذا الجدول المعلومات الأساسية اللازمة لإجراء تجربة تحرير الجينوم لأول مرة في كل من الخلايا والكائنات الحية الموضحة في هذا البروتوكول. من المرجح أن يؤدي اتباع هذه المعلمات إلى نتيجة ناجحة يمكن استخدامها لاختبار البروتوكول أو كخط أساس للمقارنة بمجرد أن يستهدف المجرب جينا من اهتمامه الخاص. F: إلى الأمام ، R: للخلف ، HDR: إصلاح موجه بالتماثل.

المواد