الأشعة فوق البنفسجية: طريقة لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Mariol ، M. C et al. بروتوكول سريع لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات ذات معدل الإرسال المرتفع في C. ايليجانس الجينوم.J. Vis. Exp.(2013).

عادة ما ينتج عن الحقن المجهري للجينات المعدلة وراثيا < p class = "jove_content" > الحقن المجهري للجينات المعدلة وراثيا سلالات C. ايليجانس ذات مصفوفات كبيرة خارج الكروموسومات ، مما يؤدي إلى تعبير متغير ونقل الجينات المعدلة وراثيا. يمكن أن يؤدي التشعيع فوق البنفسجي إلى تكامل الكروموسومات للمصفوفة ونقل الجينات المعدلة وراثيا بشكل أكثر استقرارا.

البروتوكول

هذا البروتوكول مقتطف من Mariol et al ، بروتوكول سريع لدمج المصفوفات خارج الكروموسومات بمعدل انتقال مرتفع في C. ايليجانس الجينوم ، J. Vis. Exp.(2013).

فئة

1. التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية واستعادة الديدان المعدلة وراثيا

1. تشعيع الدودة:
   1. اختر 30-100 فلورسنت معدل وراثيا L4 على ألواح استزراع منفصلة (15-20 حسب الطبق).
   2. ضع الألواح ، مع إزالة الأغطية ، في رابط متقاطع للأشعة فوق البنفسجية. تشعيع الديدان عند 0.012 جول / سم². لاحظ أن السلالات أكثر أو أقل حساسية للأشعة فوق البنفسجية وأن النتائج يمكن أن تكون متغيرة اعتمادا على جهاز الأشعة فوق البنفسجية المستخدم. يمكن اختبار نطاق الجرعة بين 0.010-0.015 جول / سم².
2. تعافي الديدان بعد التشعيع:
   1. ضع الأطباق التي تحتوي على ديدان مشعة طوال الليل عند 15 درجة مئوية للتعافي.
   2. تحقق من عدد الحية. في أيدينا ، يتم تكييف معدل البقاء على قيد الحياة من حوالي 80-90٪ من أجل تشعيع فعال.
   3. قم بزراعة المشععة عند 15-25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى مرحلة النمو مما يسمح بملاحظة تعبير علامة الحقن المشترك.

< p class = "jove_title" >2. عزل الخطوط المعدلة وراثيا المتكاملة

1. اختيار F1:
   1. مفردة من 150-200 فلورسنت F1 على ألواح استزراع منفصلة. بالنسبة لخطوط الإرسال العالية (≥80٪) ، تكفي 100 F1.
   2. احتفظ بألواح F1 هذه عند 15-25 درجة مئوية حتى يصل النسل إلى المرحلة المناسبة لمراقبة F2 الفلورية.
   3. تخلص من جميع لوحات F1 التي تظهر إما أنا) لا يوجد ذرية ، مما يشير إلى أن F1 كان معقما أو مات ، أو ب) لا يوجد أو فقط عدد قليل من الفلورية F2 ، مما يشير إلى أن F1 لم ينقل الجين المعدل بالمعدل المتوقع. هذه الخطوة سريعة وتمثل ميزة حقيقية عند مقارنتها بالبروتوكول القياسي الذي يتطلب تقديرا للنسبة المئوية لديدان F2 الفلورية من أجل تحديد لوحات F1 التي تظهر ≥75٪ ذرية فلورية (الجدول 1).
2. اختيار F2:
   1. أربعة فلورية معدلة وراثيا F2 من كل لوحة F1 مختارة. عند استخدام الجينات المعدلة والفلورسنت (على سبيل المثال mCherry أو gfp أو dsRed) ، اختر ديدان F2 ذات المستوى العالي من التألق لأن هذا قد يشير إلى أن هذه متماثلة اللواقح للمصفوفة المتكاملة. لاحظ أنه عند قطف F2 ، من الأهمية بمكان عدم حمل البيض أو اليرقات ، لتجنب السلبيات الكاذبة في الخطوة التالية.
   2. تنمو F2 عند 15-25 درجة مئوية.
3. عزل السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة والتحقق من صحتها:
   1. لوحات الشاشة F2 للديدان الفلورية المعدلة وراثيا F3 بنسبة 100٪. الشاشة سريعة جدا لأن وجود دودة واحدة غير فلورية يشير إلى أنه يجب التخلص من اللوحة. سيعطي F2 متماثل اللواقح للجين المعدل المتكامل ذرية فلورية متماثلة اللواقح بنسبة 100٪.
   2. ثمانية فلورية F3 مفردة من لوحات مختارة لتأكيد وراثة الجين المعدل وراثة بنسبة 100٪. من الناحية النظرية ، يكفي اختيار واحد في هذه الخطوة. ومع ذلك ، قد يكون اختيار ثمانية فلورية F3 ضروريا لتجنب اختيار غير الخصبة أو غير الصحية لأن التشعيع يمكن أن يؤدي بشكل عشوائي إلى حدوث طفرات تؤثر على الجينات المهمة لفسيولوجيا الديدان.
   3. إذا أمكن ، احتفظ بالعديد من السلالات المعدلة وراثيا المتكاملة المستقلة ، أي السلالات المستردة من F1 المختلفة.

النتائج

الجدول 1. مقارنة بين البروتوكولات القياسية والمحسنة لتكامل المصفوفات خارج الكروموسومات في C. ايليجانس الجينوم.تم دمج جينين معدلين غير متكاملين يرسلان بنفس التردد تقريبا باستخدام المعيار أو البروتوكول المحسن. يكمن الاختلاف الرئيسي في حقيقة أنه في البروتوكول القياسي ، يتم إجراء شاشة للذرية على جميع لوحات F1 لتقدير النسبة المئوية للديدان F2 المعدلة وراثيا ، والتي ي...

المواد

<حدود الجدول = "0" cellpadding = "0" cellpacing = "0" نمط = "العرض: 580 بكسل ؛" العرض = "579" > قائمة المواد المستخدمة في هذه المقالة الاسم الشركة رقم فهرسي التعليقات < td height = "19" نمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ العرض: 204 بكسل ؛ "> الرابط المتقاطع للأشعة فوق البنفسجية فيشر العلمية < نمط td = "العرض: 107 بكسل ؛ "> الطول الموجي 254 نانومتر < td height = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛ "> مجهر SteREO Discovery V8 كارل زايس ، إنك. أطباق بتري, 60 ملم CML BPS55E6 <ارتفاع TD = "19" النمط = "الارتفاع: 19 بكسل ؛" > سلك البلاتينيوم 0.25 مم ألفا إيسار 6/4/7440 لاختيار الديدان