< p class = "jove_title" >1. تحضير الأجنة / اليرقات
- انقل 100 جنين إلى طبق بتري 100 مم مع 25 مل من ماء البيض. احتفظ بعدم الاحتفاظ بأكثر من 100 جنين لكل طبق بتري وارفعها عند 28 درجة مئوية.
- لتثبيط التصبغ ، أضف فينيل ثيوريا (PTU) إلى أطباق بتري قبل 10 ساعات بعد الإخصاب (HPF) ، وقم برفع الأجنة / اليرقات حتى 80 حصان. التركيز النهائي ل PTU هو 0.2 ملي مولار < br / >
تحذير: PTU سامة. استخدم وفقا لإرشادات المناولة المناسبة.
- قم بتخدير اليرقات عن طريق إضافة 3 أمينو حمض البنزويك إيثيل استر (Tricaine) ، بتركيز نهائي قدره 0.016٪ ، في أطباق بتري. ثم ، باستخدام مجهر اللفائفلور ، قم بفرز اليرقات الإيجابية CFP. استخدم اليرقات ذات حجم الكبد المماثل وتخلص من اليرقات ذات الكبد الأصغر أو الأكبر.
ملاحظة: يمكن استخدام أي يرقات إيجابية CFP ، بغض النظر عن شدتها ، لأنه لا يوجد فرق في مدى استئصال خلايا الكبد بين اليرقات النصفية والمتماثلة اللواقح.
تنبيه: التريكيين سام. استخدم وفقا لإرشادات المناولة المناسبة.
- قم بإزالة ماء البيض الذي يحتوي على التريكايين وأضف ماء البيض المكمل ب 0.2 ملي وحدة حرارية بريطانية. احتفظ بالأجنة / اليرقات عند 28 درجة مئوية.
< ص الفئة = "jove_title" >2. علاج Mtz
- قم بإعداد محلول 10 ملي متر من الطن المزيري عن طريق إذابة 0.171 جم من مسحوق Mtz في 100 مل من ماء البيض مع 0.2٪ DMSO و 0.2 ملي وحدة حرارية بريطانية. لإذابة Mtz تماما ، اخلطي المحلول في RT مع التحريك السريع لمدة 20-30 دقيقة. للمساعدة في إذابة Mtz وتعزيز تغلغل Mtz في اليرقات ، أضف DMSO عند تحضير Mtz.
تنبيه: التعرض لفترات طويلة أو زيادة تركيز Mtz سام. استخدم وفقا لإرشادات المناولة المناسبة.
- افصل اليرقات إلى مجموعات تحكم وتجريبية عن طريق نقل العدد المطلوب من اليرقات إلى طبقين مختلفين من اليرقات مقاس 100 مم أو صفيحة متعددة الآبار. بالنسبة للمجموعة التجريبية ، احتفظ باليرقات في محلول 10 ملي ميغاليست ميتز. بالنسبة للمجموعة الضابطة ، احتفظ بها في ماء البيض الذي يحتوي على 0.2٪ DMSO.
- قم بتغطية الأطباق أو أطباق بتري التي تحتوي على محلول Mtz بورق الألمنيوم لمنع تعطيل الصور ل Mtz ، واحتضانها عند 28 درجة مئوية. تعتمد مدة علاج Mtz على مرحلة اليرقات والخط المعدل وراثيا.
< p class = "jove_title" >3. تحليل تجديد الكبد الذي يحركه القناة الصفراوية
- في نهاية فترة الاستئصال ، قم بإزالة محلول Mtz من الألواح. اغسل اليرقات المعالجة ب Mtz بإضافة 25 مل من ماء البيض. حرك الطبق 2-3 مرات لغسل اليرقات قبل التخلص من ماء البيض. كرر ثلاث مرات ثم اغمر اليرقات مرة أخرى في ماء البيض. لتجنب وذمة القلب وموت اليرقات في اليرقات المعالجة ب Mtz ، أضف تركيزا أقل من Tricaine ، بتركيز نهائي قدره 0.008٪ ، لشل حركة اليرقات.
- لتحليل الكبد ، افحص حجم الكبد لليرقات المعالجة ب Mtz تحت مجهر epifluorescence باستخدام مرشح CFP. تقييم مستويات استئصال خلايا الكبد بناء على حجم الكبد النسبي: كبير (غير مفصول ؛ 0-10٪ يرقات) ، متوسط (استئصال جزئي ؛ 10-20٪) ، وصغير جدا (استئصال كامل ؛ 80-90٪).
