توليد الأشعة السينية الأولية: تقنية لتحديد فاعلية الخلية

الملخص

< p class = "jove_content" >المصدر: Lombardo et al. ، مقايسة تكوين الماموسفير من أنسجة سرطان الثدي البشري وخطوط الخلايا. J. Vis. Exp. (2015).

يصف هذا الفيديو عزل الخلايا الجذعية السرطانية عن خطوط خلايا سرطان الثدي. نقوم بزراعة هذه الخلايا الجذعية السرطانية لتوليد الأشعة السينية الأولية لتقييم التجديد الذاتي وحساب كفاءة تكوين الكرة ، مما يسمح بالمقارنة عبر كثافات البذر المختلفة.

البروتوكول

< p class = "jove_title" >1. توليد الأشعة السينية الأولية من خطوط خلايا سرطان الثدي البشرية

ملاحظة: قم بتنفيذ الخطوات التالية تحت غطاء مزرعة معقم.

1. تحضير وسائط الماموسفير التي تحتوي على DMEM/F12 مكملة ب 2 مللي مولار ل-جلوتامين ، 100 وحدة / مل بنسلين ، 100 وحدة / مل ستربتومايسين. قم بإعداد وسائط كاملة مباشرة قبل الاستخدام عن طريق إضافة 20 نانوغرام / مل عامل نمو البشرة البشرية المؤتلف (EGF; سيجما) ، 10 نانوغرام / مل عامل نمو الخلايا الليفية الأساسية المؤتلفة البشرية (bFGF ؛ أنظمة البحث والتطوير) و 1x B27 الملحق.
2. استنشق الوسائط من قارورة تحتوي على خلايا MCF-7 أو MDA-MB-231 الملتصقة (أو خط خلايا سرطان الثدي من اختيارك ؛ التقاء 70-80٪) ، واغسلها مرتين في 1x PBS ، وخلايا التربسين.
3. خلايا الطرد المركزي عند 200 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. صب الطاف وإعادة تعليق الخلايا في 1-5 مل من وسط الأشعة السينية الشعاعية. الماصة لأعلى ولأسفل وإذا لزم الأمر استخدم مرشح غطاء مصفاة خلية 40 ميكرومتر للحصول على تعليق أحادي الخلية. استخدم مقياس كثافة الدم للتأكد من تكوين معلق خلية واحدة (إذا لم يكن الأمر كذلك ، فاستخدم إبرة 25 جم لحقنة تعليق الخلية حتى 3 مرات).
4. إذا لزم الأمر ، قم بعزل CD44 + CD24- المجموعة الفرعية الخلوية عبر FACS باستخدام الأجسام المضادة أحادية النسيلة المضادة ل CD24-phycoerythrin (PE) ومضادة CD44-fluoresein isothiocyanate (^{FITC) 9}. بدلا من ذلك ، قم بعزل هذه المجموعة باستخدام نظام فرز الخلايا المنشطة مغناطيسيا (MACS) مع الميكروبيدات المدمجة المضادة ل CD44 ومضادات CD24-biotin وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. قم بإجراء الاختيار الإيجابي باستخدام أعمدة LS ، والاختيار السلبي باستخدام أعمدة LD وتأكيد الأنماط الظاهرية لجميع الخلايا المعزولة عن طريق قياس التدفق الخلوي.
5. احسب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل باستخدام trypan blue.
   ملاحظه: يتم حساب بقاء الخلية على أنها عدد الخلايا القابلة للحياة مقسوما على العدد الإجمالي للخلايا داخل الشبكات الموجودة على مقياس كثافة الدم. تعتبر الخلايا التي تشغل التريبان الأزرق غير قابلة للحياة. يتم استخدام الإجراء التالي لتحديد نسبة الخلايا القابلة للحياة بدقة.
   1. تحضير محلول 0.4٪ من التريبان الأزرق في PBS. أضف 0.1 مل من محلول مرق التريبان الأزرق إلى 1 مل من الخلايا. قم بتحميل مقياس الدم وفحصه على الفور تحت المجهر بتكبير منخفض. احسب إجمالي عدد الخلايا وعدد خلايا التلوين الزرقاء. الخلايا القابلة للحياة = [1.00 - (عدد الخلايا الزرقاء ÷ عدد الخلايا الإجمالية)] × 100.
   2. لحساب عدد الخلايا القابلة للحياة لكل مل من الثقافة ، استخدم الصيغة أدناه. تذكر أن تصحح عامل التخفيف.
      عدد الخلايا القابلة للحياة × 10⁴ × 1.1 = خلايا / مل مزرعة
6. أعد تعليق كمية محددة مسبقا من الخلايا في 2 مل من وسائط الماموجير الكاملة في كل بئر من صفيحة التصاق منخفضة للغاية مكونة من 6 آبار. عادة ما تكون كثافة البذر 500-4,000 خلية / سم² خلية لكل بئر. اختياريا استخدم ألواح منخفضة التعلق 24 بئرا أثناء بذر الخلايا بنفس الكثافة في 0.5 مل من الوسائط.
   ملاحظه: نوصي بتحسين كثافة البذر ووقت الاستزراع لكل خط خلوي ذي أهمية.
7. احتضان ألواح 6 آبار منخفضة التركيب للغاية عند 37 درجة مئوية و 5٪ ثاني أكسيد الكربون₂ لمدة 5-10 أيام (اعتمادا على خط الخلية وحجم الأشعة السينية للثدي) دون إزعاج الألواح ، خاصة خلال مرحلة النمو من أول 5 أيام.

المواد