فئة
1. نقل الخلايا السرطانية المشتقة من PDX
تقوم - أجهزة الطرد المركزي بفصل الخلايا السرطانية عند 300 جم × 5 دقائق وإعادة تعليقها في وسائط الماموسفير سعة 2 مل. عد الخلايا القابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق (أعد تعليق الخلايا المهضومة في مخزن غسيل 5 مل واحسب الخلايا القابلة للحياة وغير القابلة للحياة باستخدام استبعاد التريبان الأزرق. باختصار ، امزج 50 ميكرولتر من الخلايا و 50 ميكرولتر من التريبان الأزرق وعد الخلايا الأزرق التريبان باستخدام مقياس الميرابط).
- تحضير 10 مل من وسائط الماموسفير التي تحتوي على 8 ميكروغرام / مل من البوليبرين (2 ميكرولتر من البوليبرين لكل مل من الوسائط).
- تحديد الحجم المطلوب ل 2 × 105 خلايا سرطانية قابلة للحياة. خلايا الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، وإعادة تعليق الحبيبات في 2 مل من الوسائط المحتوية على البوليبرين. لوحة 2 × 105 خلايا سرطانية قابلة للحياة لكل بئر في لوحة ثقافة أنسجة منخفضة الالتصاق ب 6 آبار.
ملاحظه: هذا هو العدد الأمثل من الخلايا المطلوبة للنقل باستخدام ناقل واحد للفيروسات العدسية.
أنذر!يجب التعامل مع جزيئات الفيروسات العدسية وجميع المواد الاستهلاكية المستخدمة مع جزيئات الفيروسات العدسية باتباع الإجراءات المؤسسية للمخاطر البيولوجية للحمض النووي المؤتلف.
ملاحظه: يفضل نقل الفيروسات العدسية لخلايا الثدي الأولية بقوة الخلايا الظهارية العضلية التي يمكن أن تؤدي إلى ضعف وضع العلامات على الخلايا اللمعية واختيار مجموعات سكانية فرعية من الخلايا السرطانية أثناء وضع العلامات.
- احتضان الفيروس ب 200 مللي وأنا / مل من النورامينيداز عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة قبل التنبيغ لزيادة ارتباط الجسيمات الفيروسية بمجموعات فرعية مختلفة من الخلايا الأولية وتصحيح هذا التحيز المحتمل.
- أضف جزيئات الفيروسات العدسية في 10 MOI (2 × 106 TU ل 2 × 105 خلايا قابلة للحياة) إذا تم استنفاد الخلايا المنفصلة PDX من خلايا الماوس Lin + أو إثرائها في خلايا EpCam +. أضف جزيئات العدسات الفيروسية عند 30 وزارة الداخلية (6 × 106 TU ل 2 × 105 خلايا قابلة للحياة) إذا كنت تستخدم خلايا غير مخصبة PDX.
ملاحظه: تسمح وزارة الداخلية المتزايدة بالنقل الفعال حتى في وجود كميات كبيرة من الحطام والخلايا الميتة في المستخلصات الخام. احتفظ بواحدة جيدا مع الخلايا غير المسماة لتكون بمثابة عنصر تحكم في الجدوى وكفاءة النقل.
- قم بالدوران لخلط الفيروس بالخلايا. احتضان عند 37 درجة مئوية ، 5٪ ثاني أكسيد الكربون2 لمدة تصل إلى 96 ساعة. أضف 500 ميكرولتر من وسائط الأشعة السينية الطازجة بعد 24 ساعة من التعداد. لن تعلق الخلايا على لوحات ، ولا تستنشق الوسائط.
فئة
2. تقييم كفاءة التنبيغ وإعادة زرع الخلايا المصنفة في الفئران التي تعاني من نقص المناعة
- راقب التعبير عن العلامة التي يمكن تتبعها (GFP) كل 24 ساعة باستخدام مجهر فلوري بتكبير 10X.
ملاحظه: يمكن ملاحظة تعبير GFP في وقت مبكر يصل إلى 24 ساعة بعد الإصابة ولكن في معظم PDXs يكون تعبير GFP مرئيا بوضوح بعد 72 ساعة (الشكل 1).
- تقدير كفاءة التنبيغ من خلال تقييم النسبة المئوية لخلايا GFP + داخل البئر الكلي.
ملاحظه: نظرا لأن الثقافات تحتوي على خلايا سرطانية وخلايا لحمية متبقية وخلايا ميتة بدرجات متفاوتة ، يمكن زرع الآبار التي تحتوي على خلايا GFP + منخفضة تصل إلى 10٪ في الفأر المضيف.
- نقل الخلايا المنقولة من ألواح 6 آبار إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. أضف 1 مل من وسط الماموسفير إلى البئر لجمع جميع الخلايا المتبقية وراءها. ضعها على الثلج.
- أضف 10 مل من HBSS / hepes إلى الخلايا المنقولة وأجهزة الطرد المركزي عند 300 × جم لمدة 5 دقائق ، 4 درجات مئوية. شفط بعناية المطفي بعناية وأعد تعليقه في 50 ميكرولتر من مستخلص المصفوفة السفلية (BME) على الثلج.
ملاحظه: يجب إذابة كميات BME على الثلج ، 1-2 ساعة قبل الاستخدام. سوف تصلب BME في درجة حرارة الغرفة ؛ حافظ على الجليد في جميع الأوقات.
- قم بتحميل الخلايا المضمنة في BME في حقنة أنسولين سعة 0.5 مل ، واحتفظ بها على الثلج ، وأحضرها إلى منشأة لإعادة زرعها في فئران NSG.
