1. الزراعة المشتركة لخلايا سرطان الثدي المجاورة لشظايا العظام لقياس تكاثر خلايا الثدي باستخدام BLI
- قبل التجربة ، قم بإعداد معلق يحتوي على 2 × 105 خلايا سرطان الثدي / 50 ميكرولتر ، وقم بإعداد سدادات من شمع العظام لتثبيت شظايا العظام في المزرعة. قم بقص طرف الماصة الدقيقة P200 إلى 3 قطع واستخدم الطرف الضيق للقطعة الأكبر بطريقة "قاطع ملفات تعريف الارتباط" لتقطيع قطع صغيرة (~ 35 مجم) من شمع العظام. استخدم الطرف العريض لأصغر قطعة لإخراج سدادات الشمع العظمي في طبق بتري للتخزين.
- ضع قطعة من شمع العظام في موضع الساعة 12 لكل بئر واضغط برفق لأسفل بإصبع السبابة المعقم.
- ماصة 50 ميكرولتر من معلق الخلية تحتوي على 1 × 105 خلايا سرطان الثدي في DMEM-10٪ FBS + Pen-Strep في وسط كل بئر من صفيحة 6 آبار. (بدلا من ذلك ، خلايا البذور في نمط مشتت إذا رغبت في ذلك.) ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 45 دقيقة لتعزيز ارتباط الخلايا.
- ضع قطعة عظم واحدة على قطعة واحدة من شمع العظام لكل بئر تجريبي واضغط برفق مع rongeur لتثبيتها. قم بإجراء تجارب في ثلاث نسخ بحيث يتم وضع 3 شظايا عظمية من عينة THR معينة في الآبار الثلاثة العلوية ، بينما تحتوي الآبار الثلاثة السفلية على شمع العظام فقط كضوابط.
- باستخدام ماصة سعة 5 مل، قم بتوصيل 5 مل من DMEM-10٪ FBS برفق وببطء إلى جانب كل بئر لتجنب إزاحة خلايا الثدي أو شظايا العظام. ضع اللوحة في حاضنة زراعة الأنسجة 37 درجة مئوية لمدة 20-24 ساعة.
- لإجراء تصوير التلألؤ الحيوي (BLI) ، قم بإزالة اللوحة من الحاضنة وأضف ركيزة لوسيفيرين (لتحقيق تركيز 300 ميكروغرام / مل) لكل بئر. قم بتصوير اللوحة على الفور على منصة IVIS Imaging باستخدام المعلمات التالية: f-stop 1 ، binning صغير ، وقت التعرض 1 ثانية ، المستوى D. قم بقياس شدة إشارة كل بئر بالإضافة إلى متوسط الإشعاع (فوتونات / ثانية / سنتيمتر مربع / ستيراديان).
- استخدم برنامج التصوير لتحديد مناطق الاهتمام (ROI) لتقدير متوسط الإشعاع لجميع الآبار التجريبية وآبار التحكم. تصدير متوسط قيم الإشعاع إلى ورقة Excel لإجراء الإحصائيات وإنشاء الرسوم البيانية.
